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Paget骨病是一种慢性进行性的代谢性骨病，以过度紊乱的骨更新为特征，可引起骨痛、骨畸形、导致病理性骨折及其他并发症，病变可累及全身一处或多处骨骼,以中轴骨和承重的四肢骨多见。病灶处发现巨大多核的破骨细胞增多，且活性增强。Paget骨病分为散发性和家族性，在西欧、北美等地区多见。该病的发病机制还未完全清楚，普遍认为环境因素与遗传因素共同影响该疾病的发生。在新西兰、澳大利亚和南非等国家中，来自高患病率地区的移民Paget骨病患病率明显高于本地人。Paget骨病患病率在种族上的差异性及家族性聚集性提示遗传因素在其发病机制中有重要作用。Paget骨病患者往往有阳性家族史，通常呈常染色体显性遗传，不完全外显率较高。近年来，随着分子遗传学技术的不断发展，人们对Paget骨病遗传病因的研究不断深入。新近研究发现，RANK/RANKL和NF-kB信号通路分子如SQSTM1/p62等基因突变与破骨细胞的异常活化及Paget骨病的发生有关，但半数以上的该病患者未发现这些突变，提示其他基因变异可能参与其发生发展。目的在对Paget骨病家系进行已知易感基因检测的基础上，利用全基因外显子测序技术筛查相关基因突变，并对筛查的疾病候选基因ASB16及FKBP5基因进行功能研究，探讨其在Paget骨病发病的作用，为深入了解其发病的遗传学机制奠定基础。方法1. SQSTM1及TNFRSF11A基因突变筛查：抽取家系成员外周血并提取全血基因组DNA，通过查阅文献确定SQSTM1及TNFRSF11A为该Paget骨病家系的基因筛查的候选基因，针对两个基因的全部外显子分别设计引物，PCR扩增，对扩增产物直接DNA测序，结果用软件Sequencher5.0Demo分析。2. ASB16基因启动子活性的研究：通过对患者全基因外显子测序，发现ASB16基因5’端+27处G/C杂合性变异。通过对正常样本测序筛查，统计ASB16基因待测位点在正常人群中基因型分布频率。应用启动子预测软件确定包括该变异位点的候选启动子区域，经PCR扩增活得该启动子基因片段，将基因片段插入pMD-18T克隆载体，构建重组克隆质粒pMD-18T/ASB16，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，通过DNA测序筛选突变型和野生型阳性克隆质粒。构建荧光素酶报告基因载体pGL3/ASB16，NheⅠ，Hind Ⅲ双酶切pMD-18T/ASB16克隆载体，将切下回收ASB16基因启动子片段插入质粒pGL3-basic中。在脂质体的作用下，将重组的荧光素酶报告基因质粒pGL3/ASB16与内参照质粒pRL-TK共转染真核细胞HEK293，培养48小时后，通过检测荧光素酶活性反应启动子活性，结果用统计学软件SPSS17.0分析。3.人FKBP5基因的克隆表达及纯化：通过对患者全基因外显子测序，在FKBP5基因中发现G/C杂合性变异。为研究该突变对FKBP5功能的影响极其在Paget骨病发病中的作用，进行野生型和突变型FKBP5表达的研究。针对目的基因片段设计引物，并加入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点，C端加入6×His的His-Tag标签。通过PCR扩增获得野生型和突变型的目的基因片段，插入pMD-18T克隆载体，构建野生型及突变型的重组克隆质粒pMD-18T/FKBP5，菌落PCR筛选阳性克隆，并DNA测序分析鉴定。分别构建野生型及突变型的pET-11d/FKBP5原核表达载体，重组克隆质粒pMD-18T/FKBP5经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，将琼脂糖凝胶电泳分离纯化的FKBP5基因片段插入双酶切后的原核表达载体pET-11d中，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR及酶切分析鉴定重组表达质粒。分别将野生型和突变型的重组质粒pET-11d/FKBP5转化BL21感受态菌株，挑取单克隆菌落培养至对数期，经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析和Western blot鉴定重组蛋白。重组人FKBP5蛋白的纯化，诱导表达的重组人FKBP5分别收集菌裂解上清和包涵体沉淀，做SDS-PAGE分析蛋白表达形式，在非变性条件下，采用Ni2+-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化，做SDS-PAGE分析目的蛋白的纯度。结果1. SQSTM1及TNFRSF11A基因突变筛查在该家系中未发现与Paget骨病共分离的致病基因突变，检测到14个已知的单核苷酸多态性。提示SQSTM1及TNFRSF11A不是该家系的致病基因。2. ASB16基因启动子活性的研究2.1正常人群ASB16突变率的研究：正常样本筛查结果ASB16基因待测位点基因型GC频率2.74%，基因型GG频率97.26%，提示该变异为新发现的SNP。2.2荧光素酶报告基因载体的构建：PCR扩增的ASB16基因候选启动子片段，电泳可见463bp处有明亮条带，与设计一致。将ASB16基因候选启动子片段与线性克隆载体pMD-18T连接后，转化DH5α，经菌落PCR筛选及DNA测序鉴定，成功获得了野生型及突变型的克隆载体pMD-18T/ASB16。分别将野生型和突变型ASB16基因候选启动子基因片段插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中，通过PCR和DNA测序鉴定正确，成功构建了野生型和突变型的荧光素酶报告基因载体pGL3/ASB16。2.3启动子活性检测：荧光素酶活性检测，与阴性对照组相比，重组的荧光素酶报告基因载体pGL3/ASB16荧光素酶活性升高（P<0.05）；野生型与突变型pGL3/ASB16相比，荧光素酶活性无显著差异（P>0.05）。提示该突变不影响ASB16启动子的活性，不是该家系致病基因。3.人FKBP5基因的克隆表达及纯化3.1表达载体的构建：PCR扩增的野生型及突变型FKBP5基因片段，电泳可见1400bp处有明亮条带，与设计一致。分别将FKBP5基因片段与线性克隆载体pMD-18T连接后，转化DH5α，经菌落PCR筛选及DNA测序鉴定，成功获得了野生型及突变型的克隆载体pMD-18T/FKBP5。通过NcoⅠ和BamHⅠ双酶切克隆载体pMD-18T/FKBP5，将FKBP5基因片段插入原核表达载体pET-11d中，并通过双酶切和菌落PCR鉴定正确，成功构建了野生型和突变型原核表达载体pET-11d/FKBP5。3.2人FKBP5蛋白的表达鉴定及纯化：野生型和突变型菌株经扩增、IPTG诱导，SDS-PAGE分析，诱导后的重组菌株在52kD处出现明显目的条带，并且目的蛋白大部分以可溶性形式表达于菌体的超声上清中。Western blot结果显示重组蛋白与抗人FKBP5多克隆抗体和抗His-Tag单克隆抗体均能发生特异性结合，表明获得的重组蛋白为特异性FKBP5蛋白。非变性条件下，采用Ni2+-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化，进行SDS-PAGE分析，FKBP5蛋白纯度达到85%以上。结论1. SQSTM1及TNFRSF11A不是该家系的致病基因：SQSTM1及TNFRSF11A的基因突变筛查中，在该家系中未发现与Paget骨病共分离的致病基因突变，检测到14个已知的单核苷酸多态性，排除这两个基因为该家系Paget骨病致病基因的可能性。2. ASB16基因上游新发现的SNP与该家系的发病无关：成功构建了野生型和突变型的荧光素酶报告基因载体pGL3/ASB16，ASB16基因候选启动子有一定的启动活性，野生型与突变型启动活性无明显差异，该位点的变异对ASB16基因的启动活性无显著影响，提示新发现的SNP和Paget病的发病无关。3.人FKBP5蛋白的表达纯化：成功构建了野生型和突变型的人FKBP5基因的原核表达载体，纯化得到了纯度较高的人FKBP5蛋白，为今后进一步对该蛋白的生物学活性及功能研究奠定了基础。