基于木质纤维素降解效果筛选白蚁源纤维素酶基因异源表达

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:xicai2009
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白蚁高效的木质纤维素分解潜力与其肠道微生物密切相关,在畜牧生产中可利用白蚁肠道微生物及其微生物来源的木质纤维素降解酶基因,将白蚁高效的降解能力用来提高粗饲料的降解率。本研究基于白蚁对槐树和柏树的消化降解效果,利用X射线衍射(XRD)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)和扫描电子显微镜(SEM)等技术测定白蚁消化降解前后纤维素结晶度指数,纤维素、半纤维素和木质素含量以及表面特征差异,通过16S r RNA基因扩增子测序技术分析白蚁肠道微生物群落差异,并以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、玉米芯木聚糖、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(p NPG)和对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(p NPC)为底物,分别测定内切葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和外切葡聚糖酶活力。根据木质纤维素降解效果和肠道中纤维降解菌的丰度,从槐树采食组中选择来自Parabacteroides属的潜在木质纤维素降解酶基因TPA,利用组氨酸标签成功从大肠杆菌中纯化出目的蛋白,以CMC-Na和玉米芯木聚糖为底物测定最适温度和最适p H。进一步利用p LEM-415载体在植物乳杆菌中实现异源表达,并通过发酵小麦秸秆验证基因功能。主要结果如下:1.X射线衍射显示槐树比柏树纤维素结晶度指数高12.2%,傅立叶变换红外光谱测定结果表明槐树中半纤维素含量更高。与采食柏树的白蚁相比,采食槐树的白蚁肠道微生物丰富度更高,且与木质纤维素降解相关指标呈显著正相关关系,其中与纤维素降解相关的Papillibacter属在槐树采食组中显著高于柏树采食组(P<0.05),预测到纤维素酶相对丰度在槐树采食组同样显著高于柏树采食组(P<0.05)。2.从槐树采食组白蚁肠道宏基因组中选择了来自Parabacteroides属的潜在木质纤维素降解酶基因TPA,经原核诱导表达,纯化出56.8 KDa的目的蛋白,最适反应温度在25-37℃,最适p H 5.5。3.TPA基因在羊瘤胃源植物乳杆菌中表达,显著提高植物乳杆菌纤维素酶比活力(P<0.05),而中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、X射线衍射及傅立叶变换红外光谱测定结果显示工程菌与植物乳杆菌宿主菌的发酵效果无差异。综上所述,白蚁能够有效降解木质纤维素,其食物中木质纤维素含量影响肠道微生物中木质纤维素降解菌Papillibacter属等的丰度,白蚁肠道微生物及其微生物来源的木质纤维素降解酶基因在秸秆类饲料资源开发中拥有巨大的应用前景。
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