【摘 要】
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禽腺病毒（Fowl Adenovirus,FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属,分为5个种（A-E）和12个血清型（1-7,8a,8b,9-11）。自2015年来,国内大部分密集养殖地区均有血清4型禽腺病毒（FAdV-4）感染导致的肝炎-心包积液综合征（HHS）爆发流行,发病鸡群死淘率可高达80%,严重限制我国家禽业的可持续发展。另外,随着国内FAdV-4灭活疫苗的获批,迫切需要建立一种高效快捷特异的
【基金项目】
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江苏省农业科技自主创新资金项目（编号:CX（19）3026）; 扬州市科技计划（现代农业）重点研发项目（编号:YZ2020051）
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禽腺病毒（Fowl Adenovirus,FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属,分为5个种（A-E）和12个血清型（1-7,8a,8b,9-11）。自2015年来,国内大部分密集养殖地区均有血清4型禽腺病毒（FAdV-4）感染导致的肝炎-心包积液综合征（HHS）爆发流行,发病鸡群死淘率可高达80%,严重限制我国家禽业的可持续发展。另外,随着国内FAdV-4灭活疫苗的获批,迫切需要建立一种高效快捷特异的FAdV-4血清学检测技术用于FAdV-4早期感染预警及疫苗效果评价。纤突蛋白（Fiber）不仅含禽腺病毒中和性表位、血清型特异性抗原决定簇,而且介导腺病毒感染入侵及致病过程中发挥重要作用。本研究在利用昆虫表达系统表达FAdV-4的两个纤突蛋白Fiber-1与Fiber-2的基础上,建立了特异性检测FAdV-4抗体的间接ELISA技术。1.FAdV-4的Fiber蛋白在昆虫表达系统中表达及其纯化首先将FAdV-4毒株SD15的纤突蛋白基因fiber-1及fiber-2分别克隆至杆状病毒载体pFast-Bac-HTA中,经转座得到穿梭质粒并转染Sf9昆虫细胞,得到分别表达Fiber-1和Fiber-2蛋白的重组杆状病毒,命名为rBv-fiber-1与rBv fiber-2。间接免疫荧光（IFA）试验表明,重组蛋白均可被抗FAdV-4特异性抗体识别。Western blot检测表明,Fiber-1和Fiber-2蛋白可实现高效可溶性表达,分子量分别为55和70 kDa。利用Ni+柱对感染重组杆状病毒的细胞裂解液上清中的Fiber-1和Fiber-2蛋白进行了纯化,纯化后的Fiber-1和Fiber-2蛋白浓度分别为0.3和0.4 mg/mL。SDS-PAGE及Western blot进一步检测表明,纯化的Fiber-1和Fiber-2蛋白均具有良好的纯度和反应原性。以上Fiber-1和Fiber-2重组蛋白的表达纯化为进一步建立FAdV-4抗体检测技术提供了生物材料。2.检测FAdV-4抗体的间接ELISA技术的建立以纯化的Fiber-1和Fiber-2蛋白分别作为特异性包被抗原,构建了检测FAdV-4抗体的间接ELISA技术,即Fiber-1ELISA与Fiber-2ELISA,采用棋盘滴定法对抗原包被浓度、待检血清稀释度、二抗工作浓度及反应时间等ELISA反应条件进行了优化,并确定 ELISA 的 Cut-off 值均为 0.1（S/P 值）。对 Fiber-1ELISA 与 Fiber-2ELISA进行特异性、灵敏度与重复性测定发现,两种ELISA具有相似的反应谱,仅与FAdV-4阳性血清反应,而与来自其他禽源病毒及禽腺病毒各血清型的抗血清均无交叉反应,具有良好的FAdV-4检测特异性;所建立的两种ELISA具有比常规IFA方法更高检测灵敏度,且批间和批内重复性变异系数均小于10%,重复性良好。与不同检测技术比较分析发现,两种ELISA所分别检测血清中Fiber-1与Fiber-2的抗体水平与中和抗体滴度有良好的相关性,同时可有效检出感染FAdV-4或免疫FAdV-4灭活疫苗的鸡群中抗FAdV-4抗体,检测结果与Biochek FAdV抗体检测试剂盒及中和试验一致。应用检测进一步证明,Fiber-1ELISA与Fiber-2ELISA可对临床鸡群免疫FAdV-4灭活疫苗或Fiber-2亚单位疫苗后产生的抗体进行针对性检测,检测灵敏度高于IFA。以上结果表明所建立的基于Fiber蛋白的检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法在FAdV-4感染诊断和免疫监控中具有良好的应用前景。
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