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脂肪分解供能是在多因素综合调控下填补奶牛产后能量供需缺口的正常生理现象,但高体况评分(BCS)奶牛产后易出现过度的脂肪分解,并导致高发病率和高淘汰率。血浆中的催乳素(PRL),以及脂肪代谢产物非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羟丁酸(BHBA)在调控产后奶牛能量代谢中有重要作用。本试验用3T3-L1前脂肪细胞株,构建肥大脂肪细胞模型;研究添加不同浓度NEFA、BHBA、PRL对成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞在脂肪分解、脂肪合成以及胰岛素信号通路等方面的调控差异作用,为揭示高BCS奶牛产后的脂肪分解机制提供理论依据。试验共分四个部分:1.肥大脂肪细胞模型的建立。将分化至第7d的3T3-L1成熟脂肪细胞,在无血清培养基(含1%BSA)中饥饿12h后,添加棕榈酸钠溶液(培养基中棕榈酸钠浓度为0、0.1、0.3、0.6、0.9mmol/L)培养24h后,测定细胞内甘油三酯(TG)含量、脂滴数量和面积。结果表明,0.3mmol/L棕榈酸钠处理组的TG含量、脂滴面积显著增加(P<0.05),各处理组间脂滴数量无显著差异(P>0.05),说明0.3mmol/L棕榈酸钠处理组可以建立肥大脂肪细胞模型。2.NEFA调控肥大脂肪细胞胰岛素信号通路的机制。分别向成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞培养基中添加不同浓度的NEFA(培养基中NEFA浓度为0、0.15、0.3、0.45mmol/L)培养9h后,采用Western Blotting测定脂肪代谢和胰岛素信号通路相关蛋白的表达量。与添加0.15、0.3、0.45mmol/LNEFA的成熟脂肪细胞处理组相比,添加同浓度NEFA的肥大脂肪细胞处理组的脂肪酸合成酶(FAS)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)的蛋白表达量显著降低(P<0.05);脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的蛋白表达量显著降低,激素敏感脂酶(HSL)的蛋白表达量显著升高(P<0.05);胰岛素信号通路相关蛋白葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的蛋白表达量和胰岛素受体底物P-IRS1(Ser307)/IRS1的比值显著升高,蛋白激酶B P-AKT(Ser473)/AKT的比值显著降低(P<0.05)。结果表明:添加0.15、0.3、0.45mmol/LNEFA抑制肥大脂肪细胞脂肪合成和胰岛素信号通路,以及促进脂肪需求脂解的能力均高于成熟脂肪细胞。3.BHBA调控肥大脂肪细胞胰岛素信号通路的机制。分别向成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞培养基中添加不同浓度BHBA(培养基中BHBA浓度为0、0.6、1.2、2.4mmol/L)培养9h后,采用Western Blotting测定脂肪代谢和胰岛素信号通路相关蛋白的表达量。与添加0.6、1.2、2.4mmol/LBHBA成熟脂肪细胞处理组相比,同浓度BHBA的肥大脂肪细胞处理组PPARγ2、FAS、HSL和ATGL的蛋白表达量显著降低(P<0.05);胰岛素信号通路相关蛋白PI3K和GLUT4的蛋白表达量以及P-AKT/AKT的比值显著降低,P-IRS1/IRS1的比值显著升高(P<0.05)。结果表明:添加0.6、1.2、2.4mmol/LBHBA抑制肥大脂肪细胞脂肪合成以及脂肪基础脂解和需求脂解的能力均高于成熟脂肪细胞,并抑制肥大脂肪细胞胰岛素信号通路。4.PRL调控肥大脂肪细胞胰岛素信号通路的机制。分别向成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞培养基中添加不同浓度PRL(培养基中PRL浓度为0、25、50、75、100、150ng/mL)培养6h后,采用Western Blotting测定脂肪代谢和胰岛素信号通路相关蛋白的表达量。与添加25、50、75ng/m LPRL的成熟脂肪细胞处理组相比,添加同浓度PRL的肥大脂肪细胞处理组的FAS和PPARγ2的蛋白表达量显著增加(P<0.05);胰岛素信号通路相关蛋白GLUT4的蛋白表达量和P-AKT/AKT的比值显著增加,P-IRS1/IRS1的比值显著降低(P<0.05),而100、150ng/mL处理组的肥大脂肪细胞结果与之相反。结果表明:添加25、50、75ng/mLPRL促进肥大脂肪细胞脂肪合成能力高于成熟脂肪细胞,并促进肥大脂肪细胞胰岛素信号通路相关蛋白的表达,但100、150ng/m LPRL抑制了肥大脂肪细胞脂肪合成以及胰岛素信号通路。综上所述,NEFA和BHBA抑制了肥大脂肪细胞胰岛素信号通路相关蛋白的表达,从而损伤其胰岛素信号通路;低浓度PRL促进了肥大脂肪细胞胰岛素信号通路相关蛋白的表达,增强胰岛素信号通路,而高浓度(100、150ng/mL)的抑制了其胰岛素信号通路相关蛋白的表达。