本实验室通过筛选一系列化合物发现，源于植物黄花蒿的活性物质东莨菪内酯对朱砂叶螨（Tetranychuscinnabarinus）具有良好的触杀、趋避以及产卵抑制等活性，具有开发成绿色杀螨剂潜力，但是其杀螨的作用机制或者分子靶标仍不清楚。因此明确东莨菪内酯对朱砂叶螨杀螨作用的机制和分子靶标，为以东莨菪内酯为模板进行分子设计，开发高效、安全、具有新的作用靶标的杀螨剂提供理论依据，为创制拥有自主知识产权的新型绿色杀螨剂奠定基础。本论文以东莨菪内酯对朱砂叶螨致毒作用的钙离子通道相关基因为研究对象，进行了东莨菪内酯对朱砂叶螨杀螨机制相关基因及分子靶标鉴定的系统研究，取得了以下研究成果：　　1.获得并验证了数字基因表达谱测序结果，明确了东莨菪内酯处理下朱砂叶螨响应基因参与的主要生物学过程处理组和溶剂对照组测序分别得到52,496,305条和52,286,859条Reads。24h和48h的差异表达基因分别为15481条和15411条。满足偏离概率值≥0.8并且log2Ratio≥1的显著差异基因分别有70条和102条。此外，qPCR证实了mRNA测序结果的准确性，也说明参与验证的15条基因确实对东莨菪内酯发生了响应。GeneOntology（GO）功能显著性富集分析明确了显著差异基因参与的主要生物学过程主要包括细胞生理过程、代谢过程、单生物过程、细胞凋亡、连接和催化活性、离子跨膜转运、神经传导等。KEGG通路富集分析罗列了24h和48h富集程度排名前20的生化代谢途径和信号转导途径，其中磷脂酰肌醇信号系统、钙信号通路和MAPK信号通路是最具代表性的生化途径。这些GO条目和KEGG条目里所包含的基因很可能与东莨菪内酯杀螨机制密切相关。　　2.获得了与螨体代谢、钙信号传导等相关的显著差异基因，测定了东莨菪内酯处理下3条钙离子通道相关基因表达量变化通过RPKM（每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数）和Noiseq算法，筛选出两处理时间段的显著差异基因总条数为172条，共有基因为18条。本研究获得了获得了3条与钙离子通道密切相关的基因，如鸟苷酸激酶（GUK）、细胞凋亡蛋白（BAG）和G蛋白偶联神经肽受体（GPCR），其是重要的信号传导类基因也是差异表达比较明显的基因；qPCR进一步检测结果表明，东莨菪内酯处理上调TcGPCR的表达，下调TcBAG和TcGUK表达，其可作为以后东莨菪内酯杀螨作用机理研究的关键基因。　　3.克隆并分析了朱砂叶螨鸟苷酸激酶、细胞凋亡蛋白和G蛋白偶联神经肽受体基因基因的cDNA序列及其表达模式通过克隆获得了鸟苷酸激酶、细胞凋亡蛋白和G蛋白偶联神经肽受体基因cDNA序列，分别命名为TcGUK，TcBAG和TcGPCR，登录号分别是：KY660540、KY660539和KY660538。此外，通过序列比对、进化树分析、蛋白跨膜结构以及结构域预测，发现其同其它物种同源性基因具有较高的相似度，其与钙离子通道密切相关，是钙离子通道相关基因。对这些钙离子通道相关基因（TcGPCR，TcBAG和TcGUK）的不同螨态表达模式分析结果显示，其在幼螨和若螨阶段的表达水平均显著高于朱砂叶螨其他发育阶段。　　4.东莨菪内酯对朱砂叶螨致毒作用的分子靶标的鉴定通过RNAi技术鉴定东莨菪内酯的作用靶标，结果发现这3条钙通道相关基因都与东莨菪内酯的杀螨活性相关；也就是，下调TcBAG和TcGUK后增强了朱砂叶螨对东莨菪内酯的敏感性，下调TcGPCR后降低了朱砂叶螨对东莨菪内酯的敏感性。另外，我们成功的把TcGPCR在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行了功能表达，同时进行了细胞内钙离子流动的测定。药理数据结果表明，东莨菪内酯以浓度依赖性的方式强烈激活TcGPCR。同时，香豆素衍生物对TcGPCR有激动活性，且其活性位点为C-6，C-7，这表明香豆素类化合物可能具有相似的分子靶点。目前的研究结果可以明确GPCR敏感型钙离子释放通道可能是天然产物杀螨剂东莨菪内酯的首要作用靶标；同时，也不能排除其他钙离子通道相关基因：TcBAG和TcGUK作为东莨菪内酯杀螨剂作用靶标的可能性。此外，香豆素类杀螨活性化合物可能具有相同的分子靶标。