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目的:1.优化大鼠阴道涂片染色方法,为准确、快速的判断动情周期提供基础。2.通过对动情周期正常的雌性大鼠的各类阴道脱落细胞进行定量分析,建立一种能精确区分动情周期四个阶段的细胞定量方法,并利用苯甲酸雌二醇(Estradiol Benzoate,E2B)给药和持续光照两个动物模型对该方法的准确性进行验证。3.应用细胞定量方法评价新药TJ1933对大鼠动情周期是否具有干扰作用。方法:1.染色方法的优化:大鼠每天上午大致相同时间采集阴道分泌物制备阴道涂片,同一份阴道液制备三份阴道涂片,分别用于巴氏染色(Papanicolaou stain,Pap)、邵氏染色(Shorr stain,S)和吉姆萨染色(Giemsa stain,G),阴道分泌物连续采集15d。涂片经固定和染色后,普通光学显微镜下评判动情周期,根据判定结果,对比三种染色方法的灵敏度、特异度和正确率,选择最佳的一种染色方法。2.定量方法的建立及验证:对动情周期正常的24只大鼠于造模前每天上下午各采集一次阴道脱落细胞,连续采集15天,制作阴道涂片720例。从720例涂片中每个阶段挑选优质的涂片45例进行细胞计数,建立细胞定量标准。15天后,12只大鼠在动情期的第一天单次皮下注射(hypodermic injection,i.h.)5ug/m L的E2B,建立E2B模型;12只大鼠24h持续光照,连续7天,建立持续光照模型。模型建立后,每天上午采集一次阴道脱落细胞,连续15d。采用建立的细胞定量方法学对两个模型组大鼠的动情周期进行评估,将评估结果与文献资料结果对比,验证定量方法的准确性和可靠性。3.在新药评价中的应用:选用健康雌性大鼠,按体重随机分为溶媒对照组、TJ1933低剂量、中剂量和高剂量组,每组10只。给药组分别灌胃给予2、6、18mg/kg的TJ1933溶液,对照组给与0.5%羧甲基纤维素钠(Carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na)溶液。每天于给药后制作阴道涂片,连续14d。经固定、邵氏染色后,应用细胞定量方法评估TJ1933对动情周期的作用。结果:1.三种染色方法对比:邵氏染色使细胞色彩鲜明、形态结构清晰,提供良好的颜色和更好的染色质细节,有利于确定不同的细胞类型;邵氏染色在动情周期判断中的灵敏度和特异度高于巴氏染色和姬姆萨染色;邵氏染色对动情周期判断结果的准确率高于巴氏染色和姬姆萨染色,达到97.8%;通过对三种染色方法的染色效果对比、结果判断的灵敏度和特异度对比、准确率比较。综合分析认为,邵氏染色是最佳的一种染色方法。2.通过对正常动情周期大鼠每阶段45例阴道脱落细胞涂片的计数,确定了动情周期四个阶段的有核上皮细胞、无核角化细胞和白细胞的比例,建立了细胞定量标准。其中,在动情前期,有核上皮细胞、无核角化细胞、白细胞的比例是7:4:1;在动情期,无核角化细胞、有核上皮细胞、白细胞的比例是4:3:1;在动情后期,白细胞、有核上皮细胞、无核角化细胞的比例是20:2:1;在动情间期,白细胞、有核上皮细胞、无核角化细胞的比例是10:2:1。应用细胞定量标准对E2B给药和持续光照大鼠建模后的动情周期进行评估,结果表明,细胞定量评估结果与文献资料结果描述一致,验证了细胞定量方法学评估大鼠动情周期变化的准确性。3.TJ1933各给药组大鼠的动情周期与溶媒对照组相比无明显差别;溶媒对照组和TJ1933各给药组雌鼠均100%交配和受孕成功,表明TJ1933对雌鼠的生殖能力无影响。结论:本课题首次在国内GLP实验室建立了大鼠动情周期定量判定方法,该方法能够准确、快速地判断动情周期,特别是在对分辩难度大的过渡期的判断上发挥更有效的作用,突破了多年来仅依靠定性方法鉴定动情周期带来的结果不准确及耗时等瓶颈,提升了雌性生殖毒性评价技术的水平和能力,进一步完善了药物非临床安全性评价技术体系,为开展新型药物安全性评价提供了重要技术保障。