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一、研究目的帕金森病（Parkinson disease,PD）病理学改变为中脑黑质的多巴胺能神经元的选择性进行性缺失。帕金森病目前以药物治疗为主,但是药物并不能减缓黑质区神经元退行性变的进程,无法阻止本病的进展,并且随着使用时间的延长,效果逐渐下降,不良作用逐渐增强。而干细胞具有自我复制、高度增殖和多向分化潜能,随着技术发展,胚胎干细胞（ESC）、神经干细胞（NSC）、骨髓间充质干细胞（MSC）可以定向诱导分化为TH阳性细胞,为细胞移植治疗PD提供了新的技术途径。但是如何促进干细胞高效定向地分化为多巴胺能神经元,为移植提供足够多的细胞,仍是急需解决的问题。TH是多巴胺能神经的神经标志物,也是儿茶酚胺类活性物质生物合成过程所需的限速酶,PD动物模型及PD患者的TH从基因表达到酶蛋白含量及酶活性都有广泛的异常改变,因此增加TH的含量也是治疗PD的途径之一。TH蛋白的表达受到TH基因的调控,而TH启动子带有多种反应元件和蛋白结合位点如CRE、TPA、NBRE及AP-1、Nurr1、Pitx3等蛋白的结合位点,可以接收相应的信号刺激调控基因转录,因此借助TH启动子可以研究药物对TH转录的影响以及确定调控转录的途径。二、研究方法和内容本实验以小鼠的基因组DNA为模版克隆了长度为1118bp（-1115/+3）的小鼠的TH启动子序列,将其连接到带有luciferase报告基因的PGL3-basic载体上,测序正确后,用磷酸钙共沉淀法转染P19胚胎瘤细胞,将龟板提取物（PTE）及其九个标准品（S1～9）、视黄酸（RA）、视黄酸受体阻断剂（Ro41）溶于二甲基亚砜（DMSO）中,阳性对照药物CPT-cAMP溶于无菌去离子水,加入低、中、高剂量的PTE及合适剂量的其它药物培养不同时间,检测Luciferase表达量,Luciferase合成量反映TH启动子的转录活性。BMP4在早期发育的神经诱导分化中有重要作用,文献报道其与多巴胺能神经分化有关,因此BMP4在PTE影响TH启动子活性的作用中所扮演的角色也是我们研究的重点。实验首先提取P19细胞总RNA,逆转录cDNA,克隆全长为1224bp的BMP4 cDNA序列,并将其连接到pEGFP载体,构建成功的质粒与TH启动子用磷酸钙法共转染P19细胞,培养液中加入30ug/ml的龟板提取物培养不同的时间。本实验小组研究曾发现,龟板能够促进局灶性脑缺血及脊髓损伤模型大鼠内源性神经干细胞增殖。为进一步研究龟板对NSC的作用,本实验培养原代胎鼠脑神经干细胞,传至Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ代,将NSC分为二份,一份经5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu）标记,培养液中加入30ug/ml PTE,5天后应用Brdu、TH免疫组化双标检测和流式细胞术检测;另一份培养液中加入30ug/ml PTE,5天后采用TH免疫细胞化学方法,观察在培养液中龟板提取物条件下NSC表型的变化。三、实验结果检测转染质粒后P19细胞luciferase和β-gal的酶活性,结果表明PGL3-basic组luciferase表达量低于PGL3-TH组,约为PGL3-TH组的1/3;阳性对照药物CPT-cAMP组luciferase表达量显著高于对照组;龟板提取物PTE和4-甾酮、十八酸乙酯能够提高luciferase表达量,PTE的作用随时间和剂量的增加而增强,十八酸乙酯的作用随时间增加而增强;RA减少luciferase表达量,并且减弱PTE的作用;过表达BMP4在早期（6h）能够提高luciferase表达量,晚期（24h）则抑制其表达;PTE与BMP4联用可以解除晚期（24h）BMP4对luciferase表达的抑制作用。流式与免疫组化结果均显示龟板提取物PTE能够显著增多体外培养NSC中TH阳性细胞数,尤其是作用Ⅱ、Ⅲ代NSC后,TH阳性细胞可以达到细胞总数的45%左右。四、结论构建的TH启动子具有转录活性;龟板提取物PTE对转染P19细胞的TH启动子转录活性的上调作用具有时间和剂量依赖性;这可能是因为作为混合物的龟板提取物中4-甾酮、甾酮具有正向调控启动子活性的作用,而RAR则起负调控作用。BMP4对TH启动子转录的调控是短暂的,晚期与PTE对TH启动子作用可能有其它蛋白协助。龟板提取物可以诱导NSC表型向多巴胺能神经元分化。