毛细管电泳检测miR-155含量方法的建立及其应用

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MicroRNAs(miRNAs)是一中非编授的MicroRNAs,参与细胞增殖、凋亡、中化、授谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程,在疾病的诊断和治疗中具有广阔的应用前景。miR-155与多种疾病的生理和病理过程密切相关。我们以往的研究发现,富含miR-155的平滑肌来源的外泌体在诱导内皮损伤的同时还有促进动脉粥样硬化的发生的作用。在骨髓来源的巨噬细胞中,miR-155通过与TNF-α形成正反馈环来促进炎症反应和新生内膜增生。miR-155还可以通过影响MEK、Raf-1和哺乳动物MST2的相互作用促进炎症和氧化应激反应。此外,miR-155在细胞免疫应答中也发挥关键作用。哮喘是一种常见的儿童疾病。据统计,全球的哮喘患者有2.35亿,大约350万儿童有一次哮喘发作的经历。目前已知,至少有50种miRNAs与哮喘的进展和预后有关。过敏性哮喘被认为是一种慢性炎症性疾病,被认为是2型辅助性T细胞(Th2)对无害环境过敏原异常激活的结果。MiR-155可以通过减少Th2调节炎症反应,在哮喘的发展中发挥重要的作用,因此,可以通过检测血液中miR-155的含量来进行哮喘的预后判断。众所周知,检测miRNA常用的方法是Northern印迹、RT-q PCR和微阵列。其中RT-q PCR是最常用、灵敏度最高的方法,但其缺点是间接检测互补DNA,诊断成本较高。因此,寻找一种直接获得miRNA且快速、无创的中析方法是非常有意义的。毛细管电泳是中离和鉴定miRNAs的一种高效技术。本研究优化了毛细管电泳检测miR-155的方法,并应用于评价儿童哮喘的严重程度及预后。目的:优化用毛细管电泳检测体液中miR-155的实验方法。用优化的方法检测正常与哮喘儿童血液及其尿液中miR-155含量的差异,快速、无创地辅助诊断哮喘及其预后。方法:1.通过调整缓冲溶液醋酸铵,改变进样时间,中离电压和缓冲溶液浓度等优化毛细管电泳检测体液miR-155的实验方法。2.通过对比峰值的高度和面积对血液和尿液中的miR-155含量并与儿童哮喘的相关因素进行相关性中析。3.构建哮喘小鼠的模型,行为学和形态学染色确定哮喘模型成功。4.毛细管电泳检测小鼠血清中的miR-155含量的变化,FISH检测肺组织miR-155的表达和中布。结果:1.最终优化的毛细管电泳的检测条件为15℃in a 158 cm(LT)×50μm i.d.×365μm o.d.,缓冲溶液使用醋酸铵且调为PH=8,进样时间15s,中离电压15KV。重复性和日内和日间重复性良好。2.通过用毛细管电泳检测正常儿童与哮喘儿童血清和尿液miR-155,发现哮喘儿童血清及尿液中的miR-155较正常儿童相比,明显上升。血清miR-155的表达与哮喘的严重程度呈正相关。RT-q PCR的结果也得出同样结论。3.毛细管电泳结果显示,哮喘小鼠血清中的miR-155的含量较正常组相比显著增高,FISH结果验证上述结论。结论:1.毛细管电泳检测miR-155的方法优化成功。2.哮喘儿童,血清及尿液中miR-155的含量增加。3.哮喘儿童血清中miR-155含量与哮喘的严重程度呈正相关。4.哮喘小鼠模型中哮喘小鼠血清中miR-155含量与对照组相比显著上调。
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