胞红蛋白在藏羚羊脑组织的基因和蛋白表达的研究

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藏羚羊常年生活在青藏高原海拔4500m以上的高寒缺氧地区,需要时却能够以60km/h连续奔跑70-100km,具有对高原低氧环境非常好的适应能力和极强的耐缺氧能力。根据国内外的研究显示:藏羚羊低氧性肺血管收缩反应钝化,肺动脉压不高,右心室无肥大;氧解离曲线左移;红细胞数、红细胞压积和血红蛋白含量在高原低氧环境下没有出现明显的异常改变,同时在低氧环境中藏羚羊还能保持较高的血氧饱和度。因此我们认为,藏羚羊是研究高原低氧适应的最佳动物模型。  胞红蛋白(cytoglobin,CGB)是于2002年被发现的携氧球蛋白。CGB基因序列与血红蛋白(hemoglobin,HGB)、肌红蛋白(myoglobin,MGB)及脑红蛋白(neuroglobin,NGB)有明显的序列同源性。CGB与HGB、MGB和NGB共同组成了携氧球蛋白家族。CGB广泛分布于多种组织和器官中,在结缔组织的细胞中CGB分布于细胞质,而在神经组织的细胞中CGB分布于细胞核和细胞质。CGB呈典型的三明治夹心型螺旋球蛋白折叠结构,CGB在生理条件下含有6个配位键,不同于HGB和MGB的5个配位键结构。根据目前的研究报道,CGB具有以下功能:携氧、储氧、氧感受器、具有过氧化物酶和过氧化氢酶活性、细胞保护、促胶原形成和抗肿瘤等功能。CGB的组织细胞分布、分子结构和生物学功能及机制还需要更多的时间和投入来研究。CGB的发现及对其的深入研究将极大的丰富机体氧运输、氧代谢和氧利用的研究。  在高原高海拔环境下,藏羚羊大脑这样一个高耗氧量的器官,在高原低氧的条件下,脑组织应该有更加有效的方式最大程度地摄取和利用有限的氧,完成正常的生理功能。我们关注到CGB与氧的高亲和力、相对低的解离率并不支持经典携氧球蛋白的携氧功能,CGB只是作为一个暂时的氧贮存器起贮氧作用,在缺氧的情况下持续地、小量地为组织细胞供氧和促进氧在线粒体中扩散。因此我们有理由相信CGB在藏羚羊脑组织表达的研究,对于进一步探讨研究藏羚羊高原低氧的适应性问题具有重要的意义。  目的:旨在克隆藏羚羊CGB基因编码区,检测CGB在成年藏羚羊不同脑区脑组织中的mRNA和蛋白表达,同时探讨藏羚羊低氧适应的分子生物学机制。  方法:(1)藏羚羊脑组织取材。(2)TRIzol试剂一步抽提法提取藏羚羊脑组织总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,从而获得目的基因。(3)实时定量基因扩增荧光检测系统,采用SYBR荧光染料,进行实时荧光定量RT-PCR反应,检测CGB在藏羚羊不同脑区脑组织中的mRNA表达。(4)蛋白免疫印记(Westernblot)检测CGB在藏羚羊不同脑区脑组织的蛋白表达。(5)SPSS16.0统计分析软件统计分析:数据用均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,以α=0.05,为检验水准,P<0.05表示差异有统计学意义。  结果:(1)将含有目的片段阳性克隆经测序和Blast分析,显示其部分编码序列与GenBank中绵羊、大鼠等同源性很高(大于90%),表明本实验所克隆的序列为CGB基因序列。(2)藏羚羊脑组织CGB蛋白藏羚羊不同脑区脑组织中有CGBmRNA表达和蛋白表达,表达量由高到低依次为:中脑、颞叶、丘脑、额叶、枕叶、顶叶、小脑、海马。  结论:CGB在藏羚羊脑组织中表达区域非常广泛,但表达量有差异,特别是在海马组织中明显的低表达。提示CGB在藏羚羊脑的功能活动中可能起重要作用。
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