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Fascin，一种肌动蛋白捆绑蛋白，近年来，在肿瘤细胞侵袭转移中的作用越来越受到研究者的关注。有研究表明，在人类正常上皮组织，Fascin一般不表达或仅表达于基底层细胞。在人类的多种恶性肿瘤中，Fascin过表达，与癌细胞的侵袭转移相关，与患者的预后差相关。有文献报道，Ser39是Fascin高度保守的磷酸化位点，位于肌动蛋白丝结合位点1。Ser39磷酸化抑制 Fascin捆绑肌动蛋白丝成束。Fascin相互作用蛋白的鉴定是一重要科学问题，将十分有助于深入揭示恶性肿瘤的发生发展分子机制。然而，迄今为止，关于Fascin相互作用蛋白鉴定的研究报道很少。鉴于此，在本课题组以往研究发现，Fascin促进食管癌细胞侵袭移动等系列研究结果的基础之上，本文拟一方面深入研究食管癌细胞中Fascin蛋白Ser39位点磷酸化修饰的功能，另一方面，尝试从食管癌细胞中鉴定Fascin某种新的相互作用蛋白。基本情况见下。 首先，将fascin编码区全长插入质粒pEGFP，构建表达载体pEGFP-fascin，并进一步利用 PCR重叠延伸法定点突变，构建两个 fascin/Ser39位点突变的表达载体， pEGFP-fascin/S39A和pEGFP-fascin/S39D。 其次，将pEGFP-fascin、pEGFP-fascin/S39A和pEGFP-fascin/S39D等质粒分别转染食管癌细胞KYSE150，检测癌细胞的移动与侵袭能力的变化，同时观察F-actin微丝的分布情况。实验结果表明，1）与转染空载体pEGFP相比，转染pEGFP-fascin，使野生型Fascin高表达，食管癌细胞KYSE150的移动与侵袭能力明显增强，F-actin微丝支撑的棘状突起增多，F-actin微丝与GFP-Fascin之间共定位；2）与转染 pEGFP-fascin相比，转染pEGFP-fascin/S39A，使突变型 Fascin/S39A高表达，食管癌细胞 KYSE150的移动与侵袭能力进一步增强，F-actin微丝支撑的棘状突起变得更多、更尖和更长，F-actin微丝与GFP-Fascin之间依然共定位；3）与转染pEGFP-fascin相比，转染pEGFP-fascin/S39D，使突变型Fascin/S39D高表达，食管癌细胞KYSE150的移动与侵袭能力明显减弱，由F-actin微丝支撑的棘状突起明显变少而且短小，F-actin微丝与GFP-Fascin之间仅部分共定位。 再次，利用免疫共沉淀、SILAC标记与蛋白质谱，在食管癌细胞KYSE180与TE3中，鉴定Fascin相互作用蛋白。实验结果提示，Annexin A2、GAPDH、Myosin-9、PCNA、Septin-2和Ubiquitin C等共21种蛋白，可能与Fascin存在着直接或间接的相互作用关系。 最后，用免疫共沉淀和免疫印迹等方法，结合他人文献报道，对上述的Annexin A2、Myosin-9和PCNA等候选Fascin相互作用蛋白给予了初步鉴定。 总之，本文实验研究证明，在食管癌细胞中，Ser39在 Fascin促进癌细胞的侵袭移动功能中发挥着关键作用；同时食管癌细胞中可能存在着某种或某些Fascin新的相互作用蛋白。