研究背景及意义 腰痛已成为当今世界致残率最高的疾病之一,造成了巨大的社会经济负担[1]。椎间盘退变是导致腰痛的最重要的病因[2]。椎间盘由以下三部分构成,位于椎间盘内部的髓核、位于椎间盘外围的纤维环和位于椎间盘上下两侧的软骨终板,其中髓核内的髓核细胞可分泌糖胺聚糖和蛋白多糖,保持大量水分,承载脊柱的压力[3]。有研究表明,髓核细胞的退变是导致椎间盘退变的主要原因。椎间盘内无血管生长,髓核细胞生存在低氧、高渗透压、低p H、高压力的环境中[4,5]。关于髓核细胞低氧环境的研究已有很多,多个研究表明,低氧条件下髓核细胞可以保持较好的生存活力,对于髓核细胞的存活很重要[6,7]。在体外研究髓核细胞过程中,保持低氧环境会是更好的一个选择。在物理低氧条件下培养髓核细胞是最理想的选择,目前较多使用的是低氧细胞培养箱,但是低氧细胞培养箱在使用过程中开关箱门会导致氧气浓度的频繁变化,对细胞培养造成不良影响[8]。有研究表明,多种细胞在常氧环境中可以用化学低氧模拟剂模拟低氧,且可以取得较好的效果。氯化钴是较常用的一种化学低氧模拟剂,已被用于多种细胞中[9,10],但在髓核细胞中的研究较少,且对于体外培养髓核细胞时氯化钴的具体作用与物理低氧的比较尚无相关研究。髓核细胞具有其特殊性,在常氧条件下髓核细胞内仍可保持一定量的HIF1α[11],是否可用氯化钴模拟髓核细胞低氧并保持相似的细胞表型仍需要进一步研究。目前椎间盘退变的治疗方法有保守疗法、物理疗法、药物治疗以及手术治疗,但由于无法逆转椎间盘的退变状态,目前的治疗方法仍存在无法使椎间盘恢复活力的问题。近些年兴起的干细胞疗法已被应用于椎间盘再生的研究之中[12,13],干细胞是具有多向分化能力的细胞,且可从多种来源获得,通过移植干细胞治疗椎间盘退变已有多项基础研究和临床研究。移植干细胞有两种选择,直接移植干细胞[14]或者通过体外培养诱导干细胞分化为髓核样细胞后再移植,但后者更加适合移植[15]。目前关于体外诱导分化的方法有多种,如通过将干细胞与髓核细胞共培养促进其向髓核样细胞分化[16],通过添加生物活性因子TGF-β等促进干细胞向髓核样细胞分化,通过低氧条件下髓核细胞与干细胞共培养促进向髓核样细胞分化[17,18],通过利用生物材料3D培养促进干细胞向髓核样细胞分化[19],通过髓核细胞外泌体促进干细胞向髓核样细胞分化[20,21,27]等。研究表明,外泌体在干细胞与髓核细胞共培养促进其向髓核样细胞分化过程中有非常重要的作用,且利用髓核细胞外泌体诱导干细胞分化可以取得更高效的作用[21,28]。髓核细胞低氧条件下外泌体是否能够提高诱导效率仍需要进一步研究。不同培养方法下的细胞分泌的外泌体内容物会发生改变。有研究表明,低氧条件下培养细胞的外泌体会发生变化且外泌体分泌量增加[23],且有多项研究表明,低氧条件下的细胞外泌体可产生一些特殊的作用[24,25],且有研究使用氯化钴低氧条件下诱导的周细胞外泌体作用于微血管发现其可以保护内皮细胞免受高糖诱导的损伤[26]。使用氯化钴低氧条件培养髓核细胞对提高其外泌体诱导间充质干细胞向髓核样细胞分化能力的影响尚未见相关报道。在我们的研究中,我们首先观察了在体外培养髓核细胞时使用氯化钴创造低氧条件的可行性,然后提取氯化钴作用下和普通条件下的髓核细胞外泌体分别作用于骨髓间充质干细胞,观察其向髓核样细胞分化的诱导能力变化,并对其过程中的可能机制进行了探究。研究方法1.大鼠椎间盘髓核细胞的提取及形态学观察。骨髓间充质干细胞的提取和观察,通过流式细胞学鉴定干细胞表面标志物CD90、CD105、CD73,无CD34及CD45;通过细胞三系分化培养鉴定细胞向成脂、成软骨、成骨方向分化的能力。2比较1%O2浓度的低氧培养箱及氯化钴条件下细胞生理学表现和常氧条件下的差异,如通过CCK-8检测细胞活力、通过AV-PE/7-AAD流式细胞学染色检测凋亡、通过PCR及WB检测细胞外基质的产生和代谢平衡,综合评估氯化钴对髓核细胞的模拟低氧作用;2.通过收集条件培养基后进行超速离心,获取氯化钴作用下和常氧培养下髓核细胞的外泌体,进行外泌体鉴定及比较（通过电镜观察形态,NTA分析大小,WB分析标志性蛋白ALIX、TSG101、CD80,BCA法测定外泌体浓度）;3.分别使用氯化钴诱导的髓核细胞外泌体和普通髓核细胞外泌体作用于骨髓间充质干细胞,比较其向髓核样细胞分化的能力,通过细胞形态（倒置显微镜）、细胞外基质的产生（COL2、ACAN）、髓核细胞常用表型（SOX9、KRT19）等进行鉴定,通过PCR检测诱导第7天、14天时骨髓间充质干细胞内髓核特异性表达基因Col2a1,Sox-9,Acan,Krt19的变化。进一步通过蛋白质印迹法、细胞外基质染色法、免疫染色法检测细胞特异性标志物COL2、ACAN、SOX9、KRT19的产生。4.氯化钴诱导的髓核细胞外泌体促使骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的机制分析,通过转录组测序（RNA-seq）,对测序结果进行GO、KEGG分析。结果1.使用氯化钴模拟低氧条件在体外培养髓核细胞时,在合适浓度下,髓核细胞的细胞活力、凋亡率、细胞外基质的代谢可以与物理低氧条件下培养的髓核细胞取得类似的效果。2.使用超速离心法获得了常氧培养下和氯化钴条件下髓核细胞的外泌体,分别进行了NTA分析、透射电镜扫描、外泌体标志蛋白的鉴定、外泌体浓度的检测,提取的外泌体大小在50-150nm之间,形态呈茶托状,且WB检测显示CD81、ALIX、TSG101高表达,而不表达CALNEXIN,外泌体浓度检测提示氯化钴诱导下髓核细胞产生的外泌体浓度更高,通过Di I对外泌体染色,通过Di O对骨髓间充质干细胞染色后共同孵育后,呈绿色的骨髓间充质干细胞内出现了红色的外泌体,证明了NPCs外泌体可被BMSCs摄取。3.通过细胞形态观察发现,使用普通髓核细胞外泌体（Nor-exo）和氯化钴髓核细胞外泌体（COCl2-exo）诱导下,COCl2-exo组的BMSCs形态在第7天发生了类似髓核样细胞形态的变化,在第14天Nor-exo组和COCl2-exo组的BMSCs形态均产生向髓核样细胞的变化。在第7天通过PCR检测发现COCl2-exo组的BMSCs在Col2a1、Acan、Krt19、Sox9表达上调量高于对照组和Nor-exo组,而在第14天COCl2-exo组、Nor-exo组Col2a1,Sox-9,Acan,Krt19与对照组相比均表达上调。在第7天通过WB检测COCl2-exo组的BMSCs的髓核细胞特征性蛋白COL2、ACAN、SOX9、KRT19均表达上调,且细胞外糖胺聚糖和蛋白多糖的染色在COCl2-exo组均较明显,通过免疫荧光染色对COL2染色发现COCl2-exo组荧光强度最强。说明COCl2-exo组在第7天已经成功诱导BMSCs向髓核样细胞分化。4.通过RNA-seq进行转录组测序分析,对测序结果进行GO分析及KEGG分析后发现COCl2-exo诱导BMSCs向髓核样细胞分化的过程可能与细胞代谢重编程中的糖代谢过程有关。结论使用氯化钴低氧条件在体外培养髓核细胞是可行的,推荐使用浓度为50μM,使用氯化钴低氧下髓核细胞的外泌体浓度较高,同时可以诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,且诱导效率更高,在第7天已经出现较明显的向髓核样细胞分化现象。其诱导分化过程可能与骨髓间充质干细胞代谢重编程的糖酵解途径有关,但其具体作用机制仍需更深入的研究。