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采用离体活性测定法,筛选了21科、30种植物的甲醇提取物对线粒体呼吸酶复合物Ⅰ的抑制作用。
根据活性追踪原理,选择蟛蜞菊全草甲醇提取物为对象进行活性成分分离鉴定。用30﹪、60﹪、90﹪和100﹪的甲醇溶解蟛蜞菊甲醇提取物,经离心后得到提取液W1、W2、W3和W4。采用C-18反相柱对各提取液进行过滤,然后用相同体积、相同含量的甲醇液洗脱,再用相同体积的纯甲醇洗脱,最后用甲醇、三氯甲烷/甲醇(4:1)及三氯甲烷洗脱,共获得12个流分。经离体呼吸酶抑制活性测定,发现流分6、7、8,即W2的甲醇洗脱流分(W2-3)、W3的过滤流分(W3-1)和W3的90﹪甲醇洗脱流分(W3-2)有较高的抑制活性,抑制率分别为82.32﹪、84.95﹪和90.81﹪。采用半制备型HPLC梯度洗脱法分别对三个高活性流分W2-3、W3-1和W3-2进行分离,各获得7、12和26个流分。进行离体呼吸酶抑制活性测定及核磁共振(NMR)氢谱解析发现,化合物ⅠⅡ、Ⅲ和Ⅳ分别为贝壳杉烯、贝壳杉烯肉桂酸酯、贝壳杉烯异戊烯酸酯和贝壳杉二烯。它们化学移位值与已报道的氢谱解析一致。进行离体酶抑制活性测定。
首次建立了以呼吸酶为靶标、适合于植物源呼吸酶抑制剂的高通量筛选方法,确定呼吸酶用量为50μg蛋白质(溶于50μL缓冲液)/孔、刃天青用量为20μM(溶于20μL缓冲液)/孔、无水乙醇(或样品溶液)用量为1μL/孔,在活性测定时需要针对每一个试样设定空白对照以抵消植物提取物对荧光度变化的影响。