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白三叶(Trifolium repens L.)是豆科(Leguminosae)三叶草属(Trifolium)多年生草本植物,又称白车轴草,是高产优质的豆科牧草。因其具有侵占性强、管理粗放、青绿期长和观赏效果好等优点,常被用作边坡绿化植物;但由于白三叶苗期生态幅窄、不耐干旱、不耐盐碱等原因,这在一定程度上限制了其应用范围。通过转基因技术,课题组已利用农杆菌浸种法获得了转胡杨PeDREB2b基因抗旱耐盐的白三叶新材料,但由于白三叶的自交不亲和性,转基因植株很难通过有性繁殖来获得稳定遗传的后代,这阻碍了其在生产实际中的应用,而利用组培体系保存转基因优良新种质和人工种子技术为其规模应用提供了新途径。本研究通过建立白三叶胚性愈伤再分化成苗的组织培养体系,研究了白三叶人工种子制作技术,为转基因白三叶的应用推广奠定了理论基础,也为客土喷播抗旱耐盐转基因白三叶人工种子进行边坡绿化提供技术支持。主要研究结果如下:(1)筛选茎段、茎尖、叶片和叶柄为外植体诱导愈伤组织,研究发现,叶柄出愈速度最快,质地疏松,叶柄两头和整个外缘都可以脱分化形成愈伤组织,愈伤组织的诱导率高于其他三种外植体。选择叶柄作为外植体,以MS+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA作为愈伤组织诱导培养基,胚性愈伤组织转化率最高,达到90%;胚性愈伤组织在继代培养基MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA中继代培养21d,愈伤组织增殖率最高。(2)胚性和非胚性愈伤组织在外部形态、组织学观察及再生性等方面存在差异。从外部特征来看,胚性愈伤组织的质地较坚实,表面有凸起颗粒,颜色为黄色或黄绿色;非胚性愈伤组织的表面质地疏松,外边缘粉状,呈水浸状,表面颜色为白色,内部为绿色;石蜡切片观察发现胚性愈伤组织的胚性细胞团紧密排列在一起,胚性细胞体积小,染色深于周围细胞,胚性细胞的细胞核体积大,位于细胞中心。非胚性愈伤组织的细胞团疏松,排列不规则,染色浅,细胞核体积小,偏于细胞的一边,有的细胞看不到细胞核。(3)在培养基MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA中,胚性愈伤组织丛生芽诱导率达到70%。在生根培养基中添加0.5mg/L 6-BA+0.6mg/L IBA,丛生芽而且生根速度快,侧根多且发达,生根率达到了90%。在不加任何激素的MS培养基中,生根速度慢,且根系瘦弱、侧根少。(4)选用垂盆草2-4mm带腋芽茎段作为包埋外植体,采用滴珠法,以MS+4%海藻酸钠+1mg/L 6-BA+0.1mg/L GA3+0.5mg/L NAA为人工胚乳,与2%CaCl2水溶液发生离子交换15min后获得的垂盆草人工种子有弹性、呈球形;播种在MS培养基中20d萌发率95%,30d生根率90%,在培养皿中催芽成苗率可达60%;此为制备垂盆草人工种子的适宜方法。(5)选择胚性愈伤组织再分化的丛生苗的带腋芽茎段作为人工种胚,以4%海藻酸钠+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L GA3+0.6mg/L IBA做人工胚乳包埋,与2%CaCl2水溶液离子交换15min,形成硬度适中且富有弹性的球形人工种子,白三叶人工种子萌发率超过70%,生根率超过60%。人工胚乳中添加活性炭抑制了人工种子的萌发。