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雷帕霉素是TOR靶向抑制剂,在调节机体衰老过程已得到广泛认可。mTOR是一种高分子量的蛋白激酶,参与调节细胞中的许多过程包括养分供应及有丝分裂等。研究表明,雷帕霉素也可通过产生ROS影响机体衰老进程。正常情况下,热休克蛋白体内检测不到只有应对外界压力时才能被检测到。mTOR的磷酸化可促进热休克蛋白Hsp90伴侣复合物的释放,伴随着Hsp90的合成能力大幅度减弱。具体调节及其相互作用机制还有待深入探究。本文通过不同雷帕霉素浓度处理下测定萼花臂尾轮虫寿命,生殖量及生殖前期;克隆TOR,S6K和S6基因片段并测定不同浓度雷帕霉素下,经过不同时间处理后基因表达量差异;测定不同雷帕霉素浓度及不同时间MnSOD,CAT,CuSOD和Hsp90基因表达量差异,为轮虫衰老机制了解提供理论基础。1.雷帕霉素与轮虫寿命、生殖研究结果表明:雷帕霉素能够延长轮虫寿命,对总生殖量及生殖前期的影响与雷帕霉素浓度有关。2和4μM处理组分别延长寿命15%和24%(P<0.05)。在受试浓度范围内轮虫寿命先增加后下降,最后寿命受到抑制。雷帕霉素浓度0.5,1.0,2.0和4.0μM处理的萼花臂尾轮虫平均子代数量与对照组(12个)相比均没有显著差异(P>0.05)。而在8.0和16.0μM处理组与对照相比子代数量明显减少(P<0.05),且抑制轮虫产子代数。随着雷帕霉素浓度的逐渐上升,各实验组的生殖前期所需时间总体上呈现出下降趋势。在0.5和1.0μM处理组生殖前期与对照(22.69 h)相比无明显影响(p>0.05),但在2.0和4.0μM雷帕霉素处理组生殖前期明显延长,显著性分析显示呈现极显著(P<0.001)。2.不同浓度雷帕霉素与TOR,S6K和S6基因表达影响克隆TOR基因片段375 bp,编码125个氨基酸;S6K基因片段951bp,编码317个氨基酸;S6基因片段735bp,编码245个氨基酸。通过利用实时荧光定量PCR技术检测轮虫衰老过程调节基因TOR,S6K和S6基因表达量变化。结果显示,TOR,S6K和S6 mRNA的表达量总体呈现先上升后下降的趋势。TOR mRNA的影响:12h处理,0.5μM处理组基因表达量显著升高是对照1.7倍(P<0.01),2.0,4.0,8.0和16μM处理组明显受到抑制(p<0.05),1.0μM处理组无显著影响p>0.05,24h和48h基因表达量聚明显升高(p<0.05),48h处理,除8.0和16.0μM处理组外,基因表达量均回归正常水平。S6K mRNA表达影响:0.5,4.0和8.0μM雷帕霉素处理基因表达量明显高于对照在12h处理时(P<0.05),2.0μM和16.0μM浓度组基因表达量相对于对照组显著抑制(P<0.05);S6mRNA表达影响:12h处理,除了 4.0和16.0μM浓度组外其余表达量均明显升高(P<0.05)。24h处理,除16.0μM处理组基因表达量明显高于对照(P<0.001)外,其余表达量均出现抑制。36h处理,0.5,1.0,2.0,8.0和16.0μM浓度组mRNA表达量明显高于对照(P<0.05)。处理48h,各实验组基因表达量均回归正常水平(P>0.05)。3.雷帕霉素与轮虫抗氧化基因和Hsp90基因表达研究本实验测定萼花臂尾轮虫在不同雷帕霉素浓度处分别理24h和48h时MnSOD,CAT,CuSOD和Hsp90基因表达量的变化。MnS(OD)mRNA雷帕霉素处理24h时,浓度组2.0μM和4μM基因表达量均明显上调(P<0.05),在8.0μM浓度组表达量最高达到约3倍(P<0.05);处理48h时,与对照组相比,2.0μM和4.0μM浓度组基因表达无显著差异(P>0.05),回归正常水平。CATmRNA基因表达影响:不同浓度雷帕霉素处理24h时,与对照组相比,2.0μM和16.0μM浓度组基因表达量均显著升高(P<0.001),16μM浓度组表达量约为对照组的12倍(P<0.001);处理48h时,2.0,4.0和8.0μM浓度组表达量相比对照组均显著升高(P<0.001)。各实验组结果显示:CuSOD表达量经过24h,48h处理,与对照组相比均显著升高(P<0.001),总体趋势呈现为先升高后下降。2.0μM和4.0μM实验组通过基因统计学分析,发现与对照相比明显增加(P<0.001),8.0μM实验组基因表达量高于对照组但低于2.0μM和4.0μM实验组(P<0.01),而16.0μM实验组基因表达量明显下降(P<0.001)。2.0μM实验组在24h处理时Hsp90基因表达量显著增加(P<0.001),基因表达量约为对照组8倍(p<0.001),48h处理时基因表达量随雷帕霉素浓度的升高先升高后下降,在2.0μM和4.0μM浓度处理时基因表达量显著高与对照组(P<0.001)。