【摘 要】
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研究背景MiRNA（microRNA）是一类长约18-24核苷酸的非编码小RNA,通过转录后调节的方式调控基因的表达,在细胞生长、分化和发育中起着重要的指导作用。因此miRNA异常表达会导致细胞功能紊乱,引起包括癌症在内的多种疾病。miRNA被认为是一种很好的疾病诊断和治疗的生物标志物,但是由于其具有低丰度、短序列、易降解和家族成员之间序列相似性高等特点,传统的检测方法难以对miRNA进行即时准确
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研究背景MiRNA（microRNA）是一类长约18-24核苷酸的非编码小RNA,通过转录后调节的方式调控基因的表达,在细胞生长、分化和发育中起着重要的指导作用。因此miRNA异常表达会导致细胞功能紊乱,引起包括癌症在内的多种疾病。miRNA被认为是一种很好的疾病诊断和治疗的生物标志物,但是由于其具有低丰度、短序列、易降解和家族成员之间序列相似性高等特点,传统的检测方法难以对miRNA进行即时准确的定量分析。为了提高miRNA检测的效率,引入了各种等温核酸扩增技术,基于等温扩增技术的检测方法在miRNA快速灵敏检测中十分具有前景。目的通过结合荧光发夹探针和等温指数扩增对miRNA进行定量分析,在验证可行性的基础上,探索合适的检测条件,以实现对miRNA的快速灵敏检测。方法1.将HP1（hairpin probe 1,发卡探针1）、HP2（hairpin probe 2,发卡探针2）、FP（fluorescent probe,荧光探针）用DEPC水稀释至10μM,95℃水浴5min,制备发卡结构探针。2.将miR-21、HP1、HP2、FP、Klenow片段（exo-）DNA聚合酶和Nb.Bbv CI核酸内切酶按一定比例加入到缓冲体系中,于37℃反应90 min进行等温指数扩增,随后80℃持续20 min,得到扩增产物。3.将扩增产物用于该分析方法的可行性分析,包括荧光分光光度计测定荧光强度验证各成分作用、聚丙烯酰胺凝胶电泳验证核酸扩增情况和熔解曲线分析荧光探针变化情况。4.通过比较不同比例的HP1、HP2和FP、不同浓度聚合酶和内切酶、不同扩增温度和时间条件下的扩增产物的荧光强度对检测条件进行优化。5.通过测定不同浓度miR-21扩增产物的荧光强度分析该方法的灵敏度和线性检测范围。6.通过测定序列相似的同家族的不同miRNA扩增产物的荧光强度分析该方法的特异性。7.通过检测从细胞中提取的RNA样本中的miR-21含量和添加人工合成的miR-21后的回收率分析该方法抗复杂基质干扰的能力。结果1.基于荧光发卡探针和等温指数扩增构建的miRNA定量分析方法方便可行,目的miRNA的存在能够启动等温指数扩增,经过两次剪切启动模板、游离核苷酸产物和重新引物延伸发夹探针的三个循环过程得到丰富的单链产物,通过与荧光探针杂交产生可检测的荧光实现信号放大,对miRNA进行快速灵敏的检测。2.构建的miRNA分析方法的最佳工作条件是在模板链比例为20:40:400的50μl反应体系中加入1.25U的Klenow片段（exo-）DNA聚合酶和5U的核酸内切酶Nb.Bbv CI,37℃条件下孵育90 min后再于80℃孵育20 min使酶灭活。3.构建的miRNA分析方法具有较好的灵敏度,检测限为5.67×10-12M,线性检测范围为100 f M～10 n M。4.构建的miRNA分析方法在检测同家族的miR-21、miR-17、miR-141、miR-155、miR-222、Let-7a和Let-7d时,只有miR-21能产生明显的荧光信号。5.构建的miRNA分析方法能够检测细胞RNA样本中的目标miRNA,回收率为98.98%。结论结合荧光发卡探针和等温指数扩增用于miRNA定量分析,具有较好的灵敏度和特异性,能够对目标miRNA进行灵敏特异的快速检测。
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