罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）（De Man,1879）属于节肢动物门、甲壳纲、长臂虾科、沼虾属,最大体长达到32 cm,是世界上最大的淡水虾。罗氏沼虾起源于印度-太平洋地区,分布于东南亚,包括马来西亚、泰国、印度和孟加拉国等国家。由于其蛋白质含量高,味道鲜美,体型较大,罗氏沼虾已经成为世界主要淡水养殖虾类。随着市场需求的增加,提高罗氏沼虾单位产量成为罗氏沼虾热点研究之一。同龄罗氏沼虾雌雄个体差异较大,雄性罗氏沼虾通常表现出更快的生长速度,更大的个体,然而群体中的大小差异不利于商业生产。因此,开发单性（全雄性）养殖方法能够提高养殖产量和增加收入。长期以来,罗氏沼虾单性养殖中一直采用人工挑选的方法来进行养殖,这种方法不仅劳动强度大而且成功率低。在科学家的努力下,人们发现促雄性腺是雄性分化、维持雄性第一和第二性征的主要器官。促雄性腺摘除以及罗氏沼虾胰岛素样促雄性腺激素（Mr IAG）和胰岛素样受体（Mr IR）的沉默可能会诱发性转变,使雄虾变成伪雌虾。伪雌虾与雄虾的交配将产生全雄性后代,有利于单性养殖。基于先进的转录组测序和分子生物学技术,促进了对罗氏沼虾性转变的深入研究。本研究采用罗氏沼虾促雄性腺摘除法、转录组分析、小干扰RNA（si RNA）沉默、双链RNA（ds RNA）沉默、原位杂交、荧光细胞共定位、RTq PCR、形态学和组织学分析等方法,探讨了促雄性腺摘除对性腺发育和性别转变的影响、研究了在不同发育阶段的性腺发育过程中,雄性相关基因的表达模式、Mr IR在雄性性腺中的定位、Mr IR与Mr IAG的相互作用,以及通过si RNA和ds RNA和沉默Mr IR与Mr IAG所引起的性别转变。主要内容和结果如下:1.促雄性腺摘除对性腺发育和性逆转的转录组分析。转录组分析产生了4232-4292万条clean reads。组装得到94,747个unigenes,总长度（160,460,655 bp）、平均长度（1,693 bp）、N50（3,438 bp）和GC（39.86%）。促雄性腺摘除后,精巢发生退化,精子的生成受阻,并诱导卵巢发育。这现象可能引发一系列的细胞过程来响应所发生的变化。值得注意的是,Hsp70、IGFBP7、Mar-Mrr、Serpin、TUBA3、CREB、EF1a、Bmp7在促雄性腺摘除后被确认为有差异表达。推测上述基因在调节性腺发育、细胞增殖、蛋白质合成和加速RNA转录方面起到重要作用。有趣的是,甲状腺激素、Rap1、细胞凋亡、hippo、催产素、PI3K、IL-17和ECM受体相互作用信号通路在性逆转过程中被富集,这些信号通路在细胞增殖、性腺发育、雌性发育调节和维持正常的体内平衡方面有调节作用。雄性罗氏沼虾的性形态特征在促雄性腺摘除后也发生了变化。首先体现在雄性性征的消失包括生殖孔、内附肢、雄性附肢和生殖孔皮瓣等,并在促雄性腺摘除后的28 d起可以观察到雌性性征,如精子收纳区、卵巢芽、卵巢刚毛和排卵刚毛等。同时,组织学观察显示促雄性腺摘除后导致精巢退化,精子发生停止,从而诱导卵巢开始发育,在促雄性腺摘除后28 d起可以观察到初级卵母细胞和发育中的卵母细胞。2.幼虾、橙爪和蓝爪罗氏沼虾的雄性性腺相关基因的表达模式。研究结果显示,Mr IAG、Mr IR、Mro Sxl1和Mro Dmrt11E的表达量在精巢中呈上升的趋势;MRPINK、Mar-Mrr在输精管中有显著的上升的趋势;而Mro Dmrt99B的表达量呈下降的趋势。Mr IAG、Mr IR、Mro Sxl1、Mro Dmrt11E、MRPINK和Mar-Mrr在蓝爪罗氏沼虾中的表达水平最高。有趣的是,Mr IAG在精巢和促雄性腺中的表达均呈上升趋势,在蓝爪罗氏沼虾中的表达水平是最高。Mr IAG、Mr IR、Mro Sxl1、Mro Dmrt11e、Mar-Mrr、Mro Dmrt99b和MRPINK在罗氏沼虾幼虾（1 cm）、橙爪罗氏沼虾和蓝爪罗氏沼虾的性腺（精巢、输精管和雄性腺）中的表达模式表明,这些基因在性腺发育中发挥关键作用。值得注意的是,大多数的基因在蓝爪罗氏沼虾阶段显示出最高的表达水平。由这一现象可以推断出蓝爪期比橙爪期有更多的生殖事件在发生。3.Mr IR定位、Mr IR和Mr IAG相互作用及si RNA沉默Mr IR诱导性转变。通过地高辛原位杂交对Mr IR在罗氏沼虾的性腺进行定位,结果发现Mr IR主要表达在精母细胞、雄性腺细胞和壶腹的分泌上皮细胞。此外,本研究利用荧光细胞共定位技术对Mr IR和Mr IAG之间进行共定位,结果推测出Mr IR是Mr IAG的受体。在甲壳类动物性腺发育研究中,本研究通过si RNA沉默方法来研究性腺发育。经反复筛选,si RNA-Mr IR敲除的最佳注射剂量为0.50μg/g,并成功获得伪雌虾。通过组织学观察,本研究进一步观察到0.50μg/g的注射剂量可以有效地延缓精巢的精子生成,导致精索小叶排列松散,仅可见到精母细胞。伪雌虾在性形态的发育上与雌性虾相似,同样含有精子收纳区、卵巢芽、卵巢刚毛和排卵刚毛。但其第二步足比雌虾相比较长,与雄虾相比较短。本实验证明了通过si RNA沉默雄性罗氏沼虾的Mr IR及0.50μg/g的注射计量能成功诱导性转变并获得伪雌虾。4.si RNA介导Mr IAG沉默诱导罗氏沼虾性别转变。Mr IAG由促雄性腺释放,有着调节精巢发育及维持雄性第一和第二性特征的关键作用。本研究使用si RNA沉默方法在雄性罗氏沼虾中沉默Mr IAG。在目前的研究中,实现性别逆转的最佳注射剂量为0.50μg/g。Mr IAG沉默后,发现Dmrt11e、Dmrt99b、MRPINK、Mar-Mrr、Sxl1和Sxl2的表达水平明显下降。通过对Mr IAG的长期沉默作用,ds RNA和si RNA方法均能成功获得伪雌虾。伪雌虾具有更宽的精子收纳区、卵巢芽、卵巢刚毛和排卵刚毛,与正常雌性的性征相似。用si RNA长期沉默后,大部分生殖细胞停滞在精母细胞阶段,但对照组的精母细胞可以进一步发育成精子。通过组织切片的观察,发现在0.50μg/g剂量的处理下,精小管排列松散,精母细胞多于精子。证明了si RNA沉默法及0.50μg/g剂量对雄性罗氏沼虾的Mr IAG进行沉默能导致性转变并获得伪雌虾。