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胃癌是我国常见的恶性肿瘤，虽然近年来治愈率有所提高，但国内5年生存率仍在20％～30％之间。随着分子生物学迅速发展，肿瘤基因治疗正逐步从实验室进入临床，但是进展十分缓慢，其主要障碍是传统基因治疗采用非增殖病毒或物理化学方法等基因传输方案，基因转染率、表达量低，载体对肿瘤细胞缺乏靶向性，从而达不到有效治愈肿瘤的目的。腺病毒载体具有感染效率和外源基因表达水平高、高滴度重组病毒的制备比较简单、适合转载大多数容量较大外源基因等特点而被广泛应用于基因治疗和临床试验。然而大多数腺病毒载体尚存在外源基因表达时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等缺点。肿瘤特异性增殖型腺病毒克服了上述腺病毒载体的不足，能够靶向肿瘤细胞增殖。且病毒本身可杀死肿瘤细胞，而不损害正常细胞，从肿瘤细胞释放出来的病毒可继续感染周围的肿瘤细胞，具有疗效的放大作用。这种新的肿瘤治疗方法称作肿瘤的病毒治疗，与传统治疗方法机制完全不同，一般不引起严重的毒副作用，无限毒剂量。其中增殖型腺病毒ONYX-015被认为是至今最为有效的肿瘤生物治疗方案。如果以增殖型腺病毒为载体携带外源治疗基因，那么目的基因的拷贝可随着病毒的增殖而扩增，在肿瘤组织中高效表达。我们将肿瘤病毒治疗和基因治疗相结合的方法称为基因—病毒治疗。 增殖型腺病毒肿瘤靶向机制的改造有多种方法，本研究采用了人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子作为调控腺病毒靶向增殖的机制。端粒酶被认为是目前发现的最广谱的肿瘤分子标记，与肿瘤无限增殖的特性有关。在胃癌中的端粒酶阳性率达85％～92％，而在绝大多数的正常细胞中无端粒酶活性。hTERT是调节端粒酶活性的主要亚单位，hTERT启动子只有在端粒酶阳性的细胞中有转录活性。因此，hTERT启动子调控的腺病毒具有特异性靶向肿瘤能力。 实体肿瘤的另一个重要特性是通过新生血管生成满足肿瘤所需的丰富血供。自从肿瘤新生血管生成(Angiogenesis)假说被证实以后，抗肿瘤新生血管生成逐渐成为肿瘤治疗策略之一，目前已经有数十种新生血管抑制剂进入临床试验，其中内皮抑素(endostatin)以其强效、无毒、无免疫原性、无耐药性等优点备受关注。 本实验将小鼠的全长内皮抑素(mEndo)基因克隆入hTERT启动子调控的增殖 第二军医大学 中文摘妄 博卜论文 型腺病毒，通过体外试验和治疗荷人胃癌裸鼠，对hTERT启动子调控的增殖型腺 病毒的抗肿瘤机制作初步探讨，为胃癌的基因一病毒治疗、抗新生血管生成基因治 疗及针对端粒酶为靶点的治疗策略提供新的思路。 1、重组携带mEndo基因肿瘤特异性增殖型腺病毒载体的构建及制备 pCAG166－mEndo和 pCAG166－GFP构建：PCR方法从pBlastmEndostatin中获 取 mEndo基因片段，通过重叠 PCR方法在 mEndo基因片段的 5’端引入 M－成瘤 蛋白的信号肽，再用 EcoRI＋BamHI酶切，回收 645hp 目的片段与 pUC用 HoRI＋BamHI双酶切后缺失3964 载体片段连接。再经EcoRI＋BamHI双酶切 鉴定及DNA测序正确后，将口收含有mEndo基因的目的片段与非增殖腺病毒载体 质粒pCA13用厂coRI＋BamAI双酶切后缺失764788hp区域的载体片段连接，构建 成 pCA13－mEndo质粒。酶切鉴定正确后，Bglll进行酶切，得到的 1080hp片段中 含有CMV启动子＋mEndostatin基因，SV40polyA加尾信号。再将该片段插入到含 hTERT启动子质粒 pCAG166的 Bglll酶切位点，构建成 pCAG166－mEndo，PCR鉴 定正确。用相同方5去从pUC－GFP构建pCAG166－GFP。 ＊ ＊ZO载体的构建：用引物丁1：5’C＊G＊＊T＊＊A＊＊C＊＊C＊＊C＊CT＊＊T GTC GAC TCG AGG TTT AAA T3’和 PZ：3AA GCT TCG CCG GCG TGA TCA CAG CTG AGC TCT AAA TTT A GGCCS’）末成连接头，插入pXC10 的A邯I酶切位点， 构建成pXC20。酶切和DNA测序鉴定正确。 pXC20－mEndO及pXC20－GFP的构建：pCAG166－ndlldo应用内切酶NOtl 和hOI 双酶切得1483bpDNA片段，插入内切酶八伙和WOI双酶切后的pXC20载体片段， 构建pXC20－InEndo。经多种方法酶切和PCR鉴定正确。相同方法构建pXC20－GFP。 病毒重组：将质粒pXC20－mEndo、pXC20－GFP及pCA13－mEndo与5含有型 腺病毒右臂的质粒pBGHE3（包含除了5型腺病毒188刁 以外的整个5型腺病 毒基因）共转染至293细胞，9刁4天后出现病毒空斑，经过H次病毒空斑纯化，腺 病毒DNA经KR进行鉴定正确，腺病毒命名为CNHK300－mE、CNHK300－GFP 及AdlnE。病毒在293细胞中反复扩增到需要量，通过氯化艳梯度离心法纯化。