论文部分内容阅读
目的有动物实验研究发现甲醛可以致肝组织损伤和氧化损伤作用，流行病学研究也发现甲醛有致癌性。本课题组以HepG2（人肝癌细胞株）为模型，证实了甲醛可致肝细胞内甘油三酯含量增加，并通过检测甲醛染毒后HepG2细胞内与脂代谢相关蛋白的含量，寻找引起肝脏甘油三酯的积累和脂肪变化的可能机制，从而为预防甲醛的滥用保护人类健康提供理论依据。方法人肝癌细胞株（HepG2）在含10%小牛血清的DMEM高糖培养基中培养，取对数生长期细胞接种于细胞培养板，分别以0.02、0.1、0.5、2.5、12.5mmol/L浓度的甲醛（Formaldehyde，FA）染毒液处理HepG2人肝癌细胞株24和48h，用CCK-8法进行细胞活性检测；采用GPO-POD酶法测定细胞内TG（甘油三酯）水平；用Hoechst33258进行核染色以观察细胞核形态学变化；检测蛋白时以0.004、0.02、0.1mmol/L浓度的甲醛处理人肝癌细胞HepG224和48h，采用Western blot法检测肉碱酯酰转移酶1（Carnitine palmitoyl transferase1，CPT1）、固醇调节元件结合蛋白-1（cSterol regulatory element-binding protern-1c，SREBP-1c）、SAR1A蛋白（Secretion-associated and Ras-related protein1A，SAR1A）、腺苷酸核糖基化因子1（ADP-ribosylation factor1，Arf1）、包被蛋白Ⅰ（Coat protein comlex Ⅰ，COPⅠ）、甘油三酯水解酶（Triacylglycerol hydrolase，TGH）和微粒体甘油三酯转运蛋白（Microsomaltriglyceride transfer protein，MTP）的蛋白表达水平；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清中极低密度脂蛋白（VLDL）水平、载脂蛋白E（ApoE）和载脂蛋白B100（ApoB100）的分泌情况。结果1、甲醛对HepG2细胞活性的影响：染毒24h后，0.5～12.5mmol/L FA作用组HepG2细胞D（470）值均低于阴性对照组（P0.05），且随着染毒浓度的增加，D（470）值逐渐降低，说明随着FA浓度的增加，对HepG2细胞活性的抑制作用逐渐增强。但0.02mmol/LFA剂量组肝细胞存活率明显高于阴性对照组，说明该剂量作用下FA对肝细胞有促进增殖作用。染毒48h后，0.1～12.5mmol/L FA作用组肝细胞活性均明显降低，进一步提示FA对肝细胞的活性抑制作用。2、Hoechst33258染色结果：24h和48h处理后，0.5、2.5、12.5mmol/L FA组荧光染色后出现大量的核呈固缩状态或颗粒状的死亡细胞，10mmol/L CP阳性对照组同样出现致密浓染的细胞核，并且细胞数量明显减少，尤其是2.5～12.5mmol/L组和阳性对照组。阴性对照组和低剂量组细胞核荧光染色较浅，细胞核未固缩。3、甲醛对HepG2细胞内甘油三酯含量的影响：经染毒24h后0.1mmol/L FA组与阴性对照组差异有统计学意义（P0.05）。48h后0.02和0.1mmol/L FA组与阴性对照组差异有统计学意义（P0.05）但是48h TG含量低于24h组，CP组TG含量48h较24h含量升高。4、甲醛染毒对HepG2细胞CPT1和SREBP-1c蛋白表达影响：在FA染毒24h后，HepG2细胞CPT1表达无明显变化，48h后表达受到明显抑制；SREBP-1c表达水平在染毒24h和48h后均高于阴性对照组，提示FA接触初期仅促进HepG2细胞内脂肪合成，随着染毒时间的延长，对脂肪酸氧化的抑制也逐渐显现。5、甲醛染毒对肝细胞TGH和MTP蛋白表达的影响：24h处理后0.1mmol/L甲醛和油酸组的TGH蛋白表达量明显增加，48h各处理组TGH表达量均显著低于阴性对照组。染毒48h后0.1mmol/L甲醛组MTP蛋白表达水平明显增加，与阴性对照组比较，差别有统计学意义（P0.05）。6、甲醛染毒对肝细胞Arf1和COPⅠ、SAR1A蛋白表达的影响：甲醛处理24h后可引起肝细胞内Arf1和COPⅠ蛋白表达水平明显增加，处理48h后，Arf1蛋白表达水平趋于正常，而COPⅠ蛋白表达水平仍高于阴性对照组。这提示甲醛接触早期，肝细胞可通过增加Arf1和COPⅠ蛋白表达，促进VLDL的分泌而减少TG在细胞内的积累。随着染毒时间的延长，这种保护作用逐渐减弱。SAR1A水平未发现显著变化。7、甲醛染毒对HepG2细胞上清中VLDL、ApoE和ApoB100含量的影响：染毒24h、48h后，各甲醛处理组细胞上清中的VLDL和ApoE含量无明显变化，与阴性对照组相比，无统计学差异（P0.05）。24h处理后，0.1mmol/L甲醛组和油酸组ApoB100含量显著低于阴性对照组，48h后，0.02、0.1mmol/L甲醛组和油酸组ApoB100含量显著低于阴性对照组（P<0.05），可能与细胞对ApoB100的再摄取有关。结论1高浓度甲醛可引起肝细胞活性明显降低，甚至出现死亡。2低浓度甲醛能够干扰肝细胞脂肪代谢，引起肝细胞内TG含量增加，其原因可能与甲醛抑制肝细胞的脂肪酸氧化，促进肝细胞TG合成有关。