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目的:优化得到条叶龙胆愈伤组织最佳培养条件,并测定龙胆苦苷含量,检测条叶龙胆愈伤组织提取物的抗肿瘤活性,并初步阐明其抗肿瘤的作用机理。方法:(1)采用ITS序列分子技术鉴定龙胆愈伤组织种属。(2)以愈伤组织鲜重净增长量和叶绿素含量为指标,采用正交试验方法优化条叶龙胆愈伤组织最佳培养条件,并测定叶绿素含量。(3)应用HPLC法,测定条叶龙胆愈伤组织中龙胆苦苷的含量。(4)MTT法检测条叶龙胆愈伤组织提取物对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。(5)应用流式细胞仪检测条叶龙胆愈伤组织提取物对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。(6)应用实时定量PCR法检测条叶龙胆愈伤组织提取物对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901凋亡蛋白相关基因表达的影响,包括Caspase 3、Caspase 9、PARP、Bcl-2、Bax 基因。(7)Western blot 法检测条叶龙胆愈伤组织提取物对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901凋亡相关蛋白表达的影响,包括Caspase 3、Caspase 9、Cleaved PARP、Bcl-2、Bax 蛋白酶。结果:(1)经ITS序列分子技术鉴定所使用的愈伤组织为条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)的愈伤组织,与形态学鉴定结果一致。(2)正交试验结果显示最佳培养条件:蔗糖浓度为30 g/L、2,4-D浓度为2.0 mg/L,6-BA和KT都为0.5 mg/L。同时提取叶绿素最佳方法为丙酮:无水乙醇——2:1较佳,并测得叶绿素含量为6.315 mg/g。(3)HPLC法测定条叶龙胆愈伤组织中龙胆苦苷含量为49.23 μg/g(干重),在进样量0.5073 μg～15.219μg范围内呈良好线性关系(r=0.9999),平均回收率为100.36%,RSD 为 1.26%(n=6),重复性 RSD=1.70%,精密度 RSD=0.31%。实验说明,该方法准确可靠,可用于龙胆苦苷含量测定。(4)MTT结果显示,给药浓度在20μg/mL～240 μg/mL之间对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901增殖有明显抑制作用,IC50值分别为75.16 μg/mL和105.1 μg/mL。(5)流式细胞仪的检测结果显示:条叶龙胆愈伤组织提取物可有效促使肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC7901的凋亡作用,且与其浓度呈正相关,呈剂量效应依赖性关系。(6)实时荧光定量PCR法检测结果显示:实验组中凋亡相关蛋白基因Caspase 3、Caspase 9、Bcl-2及PARP明显比空白组降低,而Bax显著比空白组升高。同时,Western blot法检测细胞内凋亡相关蛋白表达结果与Real-Time PCR检测结果相符。结论:所使用愈伤组织为条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)的愈伤组织,其最佳培养条件:蔗糖浓度为30 g/L、2,4-D浓度为2.0 mg/L,6-BA和KT都为0.5 mg/L,叶绿素最佳提取方法为丙酮:无水乙醇——2:1,并测得叶绿素含量为6.315 mg/g。条叶龙胆愈伤组织中龙胆苦苷含量为49.23 μg/g(干重)。给药浓度在20 μg/mL～240μg/mL之间,条叶龙胆愈伤组织提取物对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901增殖有明显抑制作用,IC50值分别为75.16 μg/mL和105.1 μg/mL,且呈剂量——效应关系。条叶龙胆愈伤组织提取物能明显上调肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901内的Cleaved PARP、Bax蛋白表达水平,并且可以显著降低Caspase 3、Caspase 9及Bcl-2蛋白表达水平,与实时荧光定量PCR实验结果相符。表明,条叶龙胆愈伤组织提取物可能通过线粒体途径导致细胞凋亡。本实验研究成果为条叶龙胆组培体系的进一步开发与可持续应用奠定了基础。