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研究目的:表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)临床上应用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的效果显著。该类药物针对的表皮生长因子受体(EGFR)被激活后,其下游多种信号通路受激活,在细胞的增殖、分化以及血管形成等方面发挥重要作用。EGFR敏感突变如19外显子缺失和21外显子L858R点突变对EGFR-TKIs反应较好,但EGFR-TKIs对含非常见EGFR突变患者的疗效尚不明确。埃可替尼(Icotinib)作为第一代EGFR抑制剂,被广泛应用于非小细胞肺癌常见EGFR敏感突变患者的治疗中且疗效显著。在前期一项随机、对照、开放、不同剂量埃可替尼二线治疗IIIB-IV期EGFR野生型非小细胞肺癌的临床试验中,探索性发现埃可替尼对一些不含敏感突变的NSCLC患者也表现出一定的疗效。本课题旨在分子水平上研究非常见EGFR突变位点对TKI抑制剂药物敏感性的影响,并解释非常见EGFR点突变对NSCLC的细胞增殖及凋亡的分子机制。研究方法:本研究对入组临床试验的11例EGFR野生型(不含19外显子缺失或21外显子L858R点突变)非小细胞肺癌患者的石蜡组织样本进行了474基因的panel测序,11例患者中其中6例在icotinib治疗后疾病缓解或稳定(有效组),另5例治疗后疾病进展(无效组)。对比分析两组间差异的EGFR突变位点后,将有效组中检测到的非常见EGFR突变在非小细胞肺癌的细胞系(HCC827和PC9)中稳定过表达。通过MTT-药物敏感性实验和平板克隆实验分析这些非常见EGFR对一代EGFR-TKIs的敏感性,通过蛋白质印迹反应实验(WB)分析非常见EGFR突变对EGFR磷酸化、细胞凋亡的影响,进而探究icotinib对非常见EGFR突变的药物敏感性,完成体外试验验证。统计学分析P值小于0.05认为有统计学意义。研究结果:根据基因测序的结果,共检测到3个非常见的EGFR突变位点:位于18外显子的点突变G724S、位于19外显子的点突变P733L和位于21外显子的点突变T854I,均在肿瘤体细胞突变数据库(COSMIC)有注释。合成EGFR点突变的慢病毒表达质粒后,我们建立了稳定表达非常见EGFR突变位点、野生型EGFR和L858R敏感突变的肺腺癌细胞系。在过表达EGFR点突变的PC9和HCC827肺腺癌细胞系中,通过MTT-药物敏感性实验证实这3例EGFR非常见点突变对TKI药物较为敏感(位于18外显子的点突变G724S、位于19外显子的点突变P733L和位于21外显子的点突变T854I)。在过表达EGFR点突变的细胞系中分别以不同浓度Icotinib处理48h后,WB实验证实三个实验组(18外显子G724S、19外显子P733L和21外显子T854I)的EGFR磷酸化受抑制程度显著强于过表达野生型的阴性对照组,且PARP和Caspase-3降解增加。同样平板克隆实验也证实该三个实验组细胞集落形成情况受盐酸埃可替尼抑制较明显,相比于阳性对照组对TKI抑制剂更敏感。研究结论:经临床实验肿瘤组织样本测序筛选得到三个非常见EGFR突变位点(18外显子G724S、19外显子P733L和21外显子T854I),通过体外实验证实该三个点突变对一代EGFR-TKIs敏感,本研究可能使非EGFR敏感突变的患者从靶向治疗中获益。