论文部分内容阅读
目的
药源性肾损伤已经成为临床中最常见的药源性疾病，其病理学变化主要表现为肾小管损伤、肾间质损伤或者肾小管和肾间质共同损伤，探明药源性肾损伤的机制和影响因素对于其临床诊治意义重大。转运体和肾脏微血流对于药物在肾脏的清除具有重要影响，且与肾损伤密切相关，而糜酶/AngⅡ是影响肾脏微血流的重要因素。因此，本实验结合细胞实验和动物实验对Oats和糜酶/AngⅡ在阿德福韦所致慢性肾损伤和甲氨蝶呤所致急性肾损伤中的作用进行了探究。
方法
(1)大鼠随机分为对照组、阿德福韦组、阿德福韦+丙磺舒组、阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组、阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组。对照组给予空白溶剂0.5%CMC-Na(1 mL/100g，i.g.)和生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)，其余组分别对应给予阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)、阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+丙磺舒(30 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)、阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+丙磺舒(30 mg/kg，i.g.)+色甘酸钠(25 mg/kg，i.p.)、阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+丙磺舒(30 mg/kg，i.g.)+缬沙坦(50 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)，每日1次，给药周期为2周和4周，于末次给药2h后，采用微透析技术收集1h的肾间质透析液，随后腹主动脉采血，并收集肾脏组织。将获得的样品相应处理后，采用LC-MS/MS测定大鼠血液、肾脏组织及肾间质中阿德福韦浓度；采用ELISA试剂盒测定血液和肾间质中AngⅡ浓度；采用全自动生化分析仪测定大鼠血清中肌酐、尿素氮、胱抑素C含量；通过甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色(HE)及CD31-免疫荧光技术分别考察大鼠肾间质肥大细胞、肾脏组织病理学及肾脏微血管的变化情况；采用Westernblotting测定肾脏组织Oat1、Oat3、Mrp2及Mrp4的表达。
(2)阿德福韦干预RBL-2H3细胞后检测细胞糜酶释放量。
(3)大鼠随机分为对照组、甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+吲哚美辛组以及吲哚美辛组，对照组给予空白溶剂生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)和纯化水(1 mL/100g， i.g.)，其余组分别对应给予甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+纯化水(1 mL/100g，i.g.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)以及吲哚美辛(10 mg/kg， i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)，单次给药48h后收集4h尿液，给药72h后腹主动脉采血，并采集肾脏组织。将获得的样品相应处理后，采用HPLC测定大鼠肾脏甲氨蝶呤浓度；采用ELISA试剂盒测定血液中AngⅡ浓度；全自动生化分析仪测定大鼠血清中肌酐、尿素氮及尿液中胱抑素C、白蛋白的含量；通过甲苯胺蓝染色、HE分别考察大鼠肾间质肥大细胞、肾脏组织病理学的变化情况；采用Westernblotting测定肾脏组织Oat1、Oat3、Mrp2及Mrp4的表达。
(4)大鼠按照(3)项下相同方法分组和给药，单次给药72h后收集1h的肾间质透析液，采用ELISA试剂盒测定肾间质AngⅡ浓度。
(5)甲氨蝶呤和吲哚美辛分别干预RBL-2H3细胞后检测细胞糜酶释放量。
(6)大鼠随机分为对照组、甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+色甘酸钠组、甲氨蝶呤+吲哚美辛组、甲氨蝶呤+吲哚美辛+色甘酸钠组、吲哚美辛组以及吲哚美辛+色甘酸钠组，对照组给予空白溶剂生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)和纯化水(1 mL/100g，i.g.)，其余组分别给予甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+纯化水(1 mL/100g， i.g.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+纯化水(1 mL/100g，i.g.)+色甘酸钠(50 mg/kg， i.p.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)+色甘酸钠(50 mg/kg，i.p.)、吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)、吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)+色甘酸钠(50 mg/kg，i.p.)，单次给药48h后收集4h尿液，给药72h后腹主动脉采血。运用全自动生化分析仪测定大鼠血清中肌酐、尿素氮及尿液中胱抑素C、白蛋白的含量。
结果
(1)大鼠给药2周后，与对照组相比，阿德福韦+丙磺舒组肾间质肥大细胞数目显著增多(P<0.05)，肾微血管丢失严重，血中AngⅡ的浓度显著增加
(P<0.05)，肾间质中AngⅡ的浓度有所增加但无显著性差异；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组和阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组肾间质肥大细胞数目显著减少(P<0.05)，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组血和肾间质中AngⅡ的浓度均有所降低但无显著性差异，而阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组血和肾间质中AngⅡ的浓度均无显著变化；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组和阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组肾微血管丢失缓解，血清中肌酐、尿素氮、胱抑素C含量均无显著变化，肾间质纤维化减轻，阿德福韦在血液和肾脏中的浓度显著降低(P<0.05/0.01)，在肾间质透析液中的浓度呈降低趋势但无统计学差异。此外，相比于阿德福韦+丙磺舒组，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组肾脏组织中转运体Oat1、Mrp2、Mrp4蛋白表达无显著变化，Oat3蛋白表达显著增加(P<0.05)，阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组Oat1、Oat3蛋白表达显著增加(P<0.05/0.01)，Mrp4蛋白表达增加但无统计学差异，Mrp2蛋白表达无显著变化。
大鼠给药4周后，与对照组相比，阿德福韦+丙磺舒组肾间质肥大细胞数目显著增多(P<0.05)，肾微血管丢失严重，血和肾间质中AngⅡ浓度非常显著性增加(P<0.01)；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组肾间质肥大细胞数目显著减少(P<0.05)，血和肾间质中AngⅡ浓度非常显著性降低(P<0.01)，肾微血管丢失明显缓解，肾间质纤维化减轻，血清中肌酐和胱抑素C含量显著降低(P<0.05)，尿素氮无显著变化，阿德福韦在肾脏组织、肾间质透析液及血液中的浓度均显著降低(P<0.05/0.01)，肾脏组织摄取型转运体Oat1和Oat3蛋白表达量非常显著性增加(P<0.01)，外排型转运体Mrp4蛋白表达也有所增加但无显著性差异，Mrp2蛋白表达无显著变化；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组肾脏肥大细胞数目显著减少(P<0.05)，血和肾间质中AngⅡ的浓度无显著变化，肾微血管丢失明显缓解，肾间质纤维化减轻，血清中肌酐、尿素氮和胱抑素C含量均无显著变化，阿德福韦在肾脏组织、肾间质透析液及血液中的浓度均显著降低(P<0.05/0.01)，肾脏组织摄取型转运体Oat1和Oat3及外排型转运体Mrp4蛋白表达量显著增加(P<0.05/0.01)，Mrp2蛋白表达无显著变化。
(2)阿德福韦干预下RBL-2H3细胞糜酶的释放具有时间依赖性和浓度依赖性。
(3)大鼠单次给药后，与对照组和甲氨蝶呤相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组尿量显著降低(P<0.05/0.01)，血清中尿素氮显著增高(P<0.05/0.01)，肾小管萎缩明显，肾脏肥大细胞数目显著增高(P<0.05)；与甲氨蝶呤组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组肾脏药物浓度显著增高(P<0.05)；与对照组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组和吲哚美辛组肾间质中AngⅡ的浓度非常显著性增高(P<0.01)，甲氨蝶呤组肾间质中AngⅡ的浓度无显著变化；与甲氨蝶呤+吲哚美辛组相比，吲哚美辛组大鼠肾间质透析液中AngⅡ浓度非常显著性增高(P<0.01)；与对照组和吲哚美辛组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组摄取型转运体Oat1、Oat3蛋白表达显著增加(P<0.05/0.01)，外排型转运体Mrp2蛋白表达非常显著性降低(P<0.01)，Mrp4蛋白表达非常显著性增加(P<0.01)。
(4)甲氨蝶呤或吲哚美辛干预RBL-2H3细胞后，糜酶的释放均具有时间依赖性和浓度依赖性。
(5)与甲氨蝶呤+吲哚美辛组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛+色甘酸钠组大鼠尿量、血清中尿素氮、肌酐含量及尿液中白蛋白和胱抑素C含量均无显著变化。
结论
(1)抑制Oats导致的阿德福韦在肾间质的长期蓄积能够促进大鼠肾间质肥大细胞募集，促使其糜酶释放量增加，进而引起肾脏AngⅡ生成增多，导致肾脏微血管丢失，并可能引起组织缺血缺氧，最终引发肾损伤；肥大细胞膜稳定剂色甘酸钠和AngⅡ受体拮抗剂缬沙坦分别通过抑制肥大细胞的糜酶释放和拮抗AngⅡ生理效应的发挥，显著减少了肾脏微血管丢失，同时促进了介导阿德福韦转运的Oat1、Oat3及Mrp4的蛋白表达，加速了阿德福韦在肾脏的清除，有效地防止了阿德福韦肾间质的蓄积，缓解了阿德福韦所致肾损伤。
(2)甲氨蝶呤合用非甾体抗炎药吲哚美辛后，大鼠肾脏摄取型转运体Oat1和Oat3表达增加，外排型转运体Mrp2表达降低，提示甲氨蝶呤可能蓄积于肾小管上皮细胞而非肾间质中，从而引起肾小管损伤。此外，色甘酸钠对各组生化指标亦无改观，提示糜酶/AngⅡ并非甲氨蝶呤所致急性肾损伤的主要影响因素。
药源性肾损伤已经成为临床中最常见的药源性疾病，其病理学变化主要表现为肾小管损伤、肾间质损伤或者肾小管和肾间质共同损伤，探明药源性肾损伤的机制和影响因素对于其临床诊治意义重大。转运体和肾脏微血流对于药物在肾脏的清除具有重要影响，且与肾损伤密切相关，而糜酶/AngⅡ是影响肾脏微血流的重要因素。因此，本实验结合细胞实验和动物实验对Oats和糜酶/AngⅡ在阿德福韦所致慢性肾损伤和甲氨蝶呤所致急性肾损伤中的作用进行了探究。
方法
(1)大鼠随机分为对照组、阿德福韦组、阿德福韦+丙磺舒组、阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组、阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组。对照组给予空白溶剂0.5%CMC-Na(1 mL/100g，i.g.)和生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)，其余组分别对应给予阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)、阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+丙磺舒(30 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)、阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+丙磺舒(30 mg/kg，i.g.)+色甘酸钠(25 mg/kg，i.p.)、阿德福韦(10 mg/kg，i.g.)+丙磺舒(30 mg/kg，i.g.)+缬沙坦(50 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)，每日1次，给药周期为2周和4周，于末次给药2h后，采用微透析技术收集1h的肾间质透析液，随后腹主动脉采血，并收集肾脏组织。将获得的样品相应处理后，采用LC-MS/MS测定大鼠血液、肾脏组织及肾间质中阿德福韦浓度；采用ELISA试剂盒测定血液和肾间质中AngⅡ浓度；采用全自动生化分析仪测定大鼠血清中肌酐、尿素氮、胱抑素C含量；通过甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色(HE)及CD31-免疫荧光技术分别考察大鼠肾间质肥大细胞、肾脏组织病理学及肾脏微血管的变化情况；采用Westernblotting测定肾脏组织Oat1、Oat3、Mrp2及Mrp4的表达。
(2)阿德福韦干预RBL-2H3细胞后检测细胞糜酶释放量。
(3)大鼠随机分为对照组、甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+吲哚美辛组以及吲哚美辛组，对照组给予空白溶剂生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)和纯化水(1 mL/100g， i.g.)，其余组分别对应给予甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+纯化水(1 mL/100g，i.g.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)以及吲哚美辛(10 mg/kg， i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)，单次给药48h后收集4h尿液，给药72h后腹主动脉采血，并采集肾脏组织。将获得的样品相应处理后，采用HPLC测定大鼠肾脏甲氨蝶呤浓度；采用ELISA试剂盒测定血液中AngⅡ浓度；全自动生化分析仪测定大鼠血清中肌酐、尿素氮及尿液中胱抑素C、白蛋白的含量；通过甲苯胺蓝染色、HE分别考察大鼠肾间质肥大细胞、肾脏组织病理学的变化情况；采用Westernblotting测定肾脏组织Oat1、Oat3、Mrp2及Mrp4的表达。
(4)大鼠按照(3)项下相同方法分组和给药，单次给药72h后收集1h的肾间质透析液，采用ELISA试剂盒测定肾间质AngⅡ浓度。
(5)甲氨蝶呤和吲哚美辛分别干预RBL-2H3细胞后检测细胞糜酶释放量。
(6)大鼠随机分为对照组、甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤+色甘酸钠组、甲氨蝶呤+吲哚美辛组、甲氨蝶呤+吲哚美辛+色甘酸钠组、吲哚美辛组以及吲哚美辛+色甘酸钠组，对照组给予空白溶剂生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)和纯化水(1 mL/100g，i.g.)，其余组分别给予甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+纯化水(1 mL/100g， i.g.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+纯化水(1 mL/100g，i.g.)+色甘酸钠(50 mg/kg， i.p.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)、甲氨蝶呤(360 mg/kg，i.p.)+吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)+色甘酸钠(50 mg/kg，i.p.)、吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)+生理盐水(0.25 mL/100g，i.p.)、吲哚美辛(10 mg/kg，i.g.)+色甘酸钠(50 mg/kg，i.p.)，单次给药48h后收集4h尿液，给药72h后腹主动脉采血。运用全自动生化分析仪测定大鼠血清中肌酐、尿素氮及尿液中胱抑素C、白蛋白的含量。
结果
(1)大鼠给药2周后，与对照组相比，阿德福韦+丙磺舒组肾间质肥大细胞数目显著增多(P<0.05)，肾微血管丢失严重，血中AngⅡ的浓度显著增加
(P<0.05)，肾间质中AngⅡ的浓度有所增加但无显著性差异；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组和阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组肾间质肥大细胞数目显著减少(P<0.05)，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组血和肾间质中AngⅡ的浓度均有所降低但无显著性差异，而阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组血和肾间质中AngⅡ的浓度均无显著变化；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组和阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组肾微血管丢失缓解，血清中肌酐、尿素氮、胱抑素C含量均无显著变化，肾间质纤维化减轻，阿德福韦在血液和肾脏中的浓度显著降低(P<0.05/0.01)，在肾间质透析液中的浓度呈降低趋势但无统计学差异。此外，相比于阿德福韦+丙磺舒组，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组肾脏组织中转运体Oat1、Mrp2、Mrp4蛋白表达无显著变化，Oat3蛋白表达显著增加(P<0.05)，阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组Oat1、Oat3蛋白表达显著增加(P<0.05/0.01)，Mrp4蛋白表达增加但无统计学差异，Mrp2蛋白表达无显著变化。
大鼠给药4周后，与对照组相比，阿德福韦+丙磺舒组肾间质肥大细胞数目显著增多(P<0.05)，肾微血管丢失严重，血和肾间质中AngⅡ浓度非常显著性增加(P<0.01)；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+色甘酸钠组肾间质肥大细胞数目显著减少(P<0.05)，血和肾间质中AngⅡ浓度非常显著性降低(P<0.01)，肾微血管丢失明显缓解，肾间质纤维化减轻，血清中肌酐和胱抑素C含量显著降低(P<0.05)，尿素氮无显著变化，阿德福韦在肾脏组织、肾间质透析液及血液中的浓度均显著降低(P<0.05/0.01)，肾脏组织摄取型转运体Oat1和Oat3蛋白表达量非常显著性增加(P<0.01)，外排型转运体Mrp4蛋白表达也有所增加但无显著性差异，Mrp2蛋白表达无显著变化；与阿德福韦+丙磺舒组相比，阿德福韦+丙磺舒+缬沙坦组肾脏肥大细胞数目显著减少(P<0.05)，血和肾间质中AngⅡ的浓度无显著变化，肾微血管丢失明显缓解，肾间质纤维化减轻，血清中肌酐、尿素氮和胱抑素C含量均无显著变化，阿德福韦在肾脏组织、肾间质透析液及血液中的浓度均显著降低(P<0.05/0.01)，肾脏组织摄取型转运体Oat1和Oat3及外排型转运体Mrp4蛋白表达量显著增加(P<0.05/0.01)，Mrp2蛋白表达无显著变化。
(2)阿德福韦干预下RBL-2H3细胞糜酶的释放具有时间依赖性和浓度依赖性。
(3)大鼠单次给药后，与对照组和甲氨蝶呤相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组尿量显著降低(P<0.05/0.01)，血清中尿素氮显著增高(P<0.05/0.01)，肾小管萎缩明显，肾脏肥大细胞数目显著增高(P<0.05)；与甲氨蝶呤组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组肾脏药物浓度显著增高(P<0.05)；与对照组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组和吲哚美辛组肾间质中AngⅡ的浓度非常显著性增高(P<0.01)，甲氨蝶呤组肾间质中AngⅡ的浓度无显著变化；与甲氨蝶呤+吲哚美辛组相比，吲哚美辛组大鼠肾间质透析液中AngⅡ浓度非常显著性增高(P<0.01)；与对照组和吲哚美辛组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛组摄取型转运体Oat1、Oat3蛋白表达显著增加(P<0.05/0.01)，外排型转运体Mrp2蛋白表达非常显著性降低(P<0.01)，Mrp4蛋白表达非常显著性增加(P<0.01)。
(4)甲氨蝶呤或吲哚美辛干预RBL-2H3细胞后，糜酶的释放均具有时间依赖性和浓度依赖性。
(5)与甲氨蝶呤+吲哚美辛组相比，甲氨蝶呤+吲哚美辛+色甘酸钠组大鼠尿量、血清中尿素氮、肌酐含量及尿液中白蛋白和胱抑素C含量均无显著变化。
结论
(1)抑制Oats导致的阿德福韦在肾间质的长期蓄积能够促进大鼠肾间质肥大细胞募集，促使其糜酶释放量增加，进而引起肾脏AngⅡ生成增多，导致肾脏微血管丢失，并可能引起组织缺血缺氧，最终引发肾损伤；肥大细胞膜稳定剂色甘酸钠和AngⅡ受体拮抗剂缬沙坦分别通过抑制肥大细胞的糜酶释放和拮抗AngⅡ生理效应的发挥，显著减少了肾脏微血管丢失，同时促进了介导阿德福韦转运的Oat1、Oat3及Mrp4的蛋白表达，加速了阿德福韦在肾脏的清除，有效地防止了阿德福韦肾间质的蓄积，缓解了阿德福韦所致肾损伤。
(2)甲氨蝶呤合用非甾体抗炎药吲哚美辛后，大鼠肾脏摄取型转运体Oat1和Oat3表达增加，外排型转运体Mrp2表达降低，提示甲氨蝶呤可能蓄积于肾小管上皮细胞而非肾间质中，从而引起肾小管损伤。此外，色甘酸钠对各组生化指标亦无改观，提示糜酶/AngⅡ并非甲氨蝶呤所致急性肾损伤的主要影响因素。