在世界范围内,结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)的发病率以及其死亡率在恶性肿瘤中均位居于第三位。研究发现,CRC在亚洲地区中的经济较发达的地区,其发生率也呈现逐年增长的趋势。CRC的发病率在我国也呈现出逐步上升之趋势。CRC已经严重威胁到我国人民的健康,因而深入的探索CRC发病的机制以及治疗手段就成了研究热点。作为一种非编码小RNA,microRNA即miRNA在基因的调控、表达等方面有着重要的作用。多项研究表明miRNA的表达失调和CRC的发生及发展存在密切的关联关系。已有的研究表明,miR-143可能参与调节CRC细胞生长,细胞凋亡和某些化疗反应关键蛋白,但其具体的作用机制、调控途径、与CRC遗传易感性等有待于进一步深入的研究和阐明。本研究从miR-143对结直肠癌细胞生物学行为的影响、miR-143对结直肠癌细胞中Survivi、C-myc表达的影响、miR-143联合奥沙利铂对结直肠癌细胞的作用影响、miR-143基因启动子区多态性与结直肠癌遗传易感性的关系等四个方面对miR-143在结直肠癌发生发展中的作用机制做了初步的探讨和研究。miR-143对结直肠癌细胞生物学行为的影响目的：研究过表达miR-143在结直肠癌细胞中对其生物学行为的影响。方法：构建miR-143真核表达载体,用lipofectamine2000脂质体转染SW-480细胞,建立稳定高表达的miR-143细胞系。采用Realtime-PCR技术鉴定转染效率。并分别运用流式细胞、transwell以及MTT检测细胞的凋亡、侵袭和增殖等特征。结果：两组载体转染组均有明显的GFP表达。其中1μgpGenesil-1-miR-143载体组和2μg pGenesil-1-miR-143载体组的miR-143的相对表达量分别为10.61±0.36和12.83±0.38,而对照组的miR-143的相对表达量为2.53±0.83。1μg pGenesil-1载体组细胞,2μgpGenesil-1载体组细胞穿过基底膜细胞明显少于对照组细胞。两组实验组与对照组相比能使细胞凋亡增加,细胞周期较多停滞在G2期。MTT结果显示两组实验组细胞生长活力较对照组均明显降低,并且的MTT值在48h、72h、96h及120h均有显著性差异(P<0.05)。结论：成功构建miR-143真核表达载体。转染SW-480构建了稳定高表达mir-143的CRC细胞系；miR-143对CRC SW480肿瘤细胞的凋亡、生长活力和侵袭等细胞生物学行为有明显的影响作用；miR-143在CRC细胞中起到抑癌基因的作用。miR-143对结直肠癌细胞中Survivin、C-myc表达的影响目的：研究miR-143对结直肠癌细胞中Survivin、C-myc表达的影响,从而探讨miR-143在结直肠癌中可能的靶基因。方法：将结肠癌细胞SW-480细胞分为4组,未处理对照组,1μgpGenesil-1-miR143载体组,5μg pGenesil-1-miR143载体组和10μgpGenesil-l-miR143载体组。在转染实验完成后通过realtime PCR检测不同组别的miR-143和survivin。c-myc表达的变化,并采用统计学方法分析miR-143和survivin、miR-143和c-myc表达的关联。通过western-blot检测Akt信号通路的变化。结果：3组实验组miR143的表达水平均显著性高于对照组(P<0.05)。其中,5μg pGenesil-1-miR143组的miR-143表达量明显高于其它组,且有显著性差异(P<0.05)；3组实验组c-myc基因的表达水平较对照组无显著性差异(P>0.05)。相关性分析证明miR-143和C-myc基因的表达量成无相关性。其相关系数为-0.06；3组实验组Survivin基因的表达水平均显著性低于对照组(P<0.05)。相关性分析证实miR-143和Survivin基因的表达量成显著性负相关。其相关系数达-0.95; western-blot蛋白印迹检测结果显示在miR-143转染过表达后,3组实验组的AKT磷酸化水平较对照组明显降低。结论：C-myc的表达和miR-143的表达相关性不明显；Survivin的表达和miR-143的表达有显著负相关性。Survivin的表达受到miRNA-143的负性调控,是其靶基因之一；通过降低Akt磷酸化水平下调Survivin基因的表达是miR-143影响Survivin表达的可能途径之一。miR-143联合奥沙利铂作用对结直肠癌细胞的作用影响目的：研究miR-143联合奥沙利铂作用对结直肠癌细胞的作用影响。方法：将结肠癌细胞系分为4组,包括未处理对照组、奥沙利铂处理组、mir-143过表达组、奥沙利铂+mir-143过表达组。实验处理2天后,采用TUNEL技术分析对细胞凋亡的影响；利用流式细胞技术检测对细胞凋亡、细胞周期的影响；MTT实验检测对细胞生长活力的影响；然后采用realtime PCR, Western-blot分析miR-143对DNMT3A、 DNMT3B、DNMT1、Bcl-2、caspase-3等肿瘤因子的表达的影响。结果：TUNEL技术检测结果：在4个组别中,mir-143过表达组和奥沙利铂+mir-143过表达组对SW-480细胞有较明显的凋亡作用,并且以奥沙利铂+mir-143过表达联合作用组对SW-480细胞的凋亡作用为最明显；流式细胞技术检测结果：3组实验组和未处理对照组相比能使细胞凋亡增加,而且细胞周期较多停滞在G2、G2/M期。而且,奥沙利铂处理组对细胞凋亡的作用又低于mir-143过表达组和奥沙利铂+mir-143过表达组。但是在mir-143过表达组和奥沙利铂+mir-143过表达组见对比则无显著性差异；MTT实验检测结果：mir-143过表达组和奥沙利铂+mir-143过表达组细胞生长活力较对照组明显降低,并且其MTT值在72h、96h及120h均有显著性差异(P<0.05)。且奥沙利铂+mir-143过表达组与奥沙利铂组比较MTT值在96h、120h有明显下降；在Realtime PCR检测中,对于DNMT3A和DNMT3B基因,mir-143过表达组和奥沙利铂+mir-143过表达组的这个两个基因表达明显低于未处理对照组和奥沙利铂处理组(P<0.05)。但是未处理对照组和奥沙利铂处理组的表达未见有显著性差异(P>0.05)。而DNMT1在3组实验组中表达量均显著性低于未处理对照组(P<0.05)。Western blot的结果也证实了蛋白水平的表达差异：DNMT3A、 DNMT3B、DNMT1这3个基因在mir-143过表达组、奥沙利铂+miR-143组都有明显的表达水平降低；3组实验组的Bcl-2基因表达明显低于未处理对照组(P<0.05),Bcl-2基因在奥沙利铂+mir-143过表达组的表达量最低并且明显低于奥沙利铂处理组.、miR-143过表达组的表达(P<0.05)。caspase-3基因的RNA水平则在未处理对照组的表达量最低,在奥沙利铂+mir-143过表达组的表达量最高；而且奥沙利铂处理组的表达明显低于奥沙利铂+mir-143过表达组(P<0.05)。Western blot的结果也证实了蛋白水平的表达差异：与对照组相比,在3组实验组中Bcl-2均有不同程度的表达下降而caspase-3则均有不同程度的表达上升。结论：miR-143在CRC细胞中过表达对奥沙利铂的敏感性有明显的增强作用；奥沙利铂+miR-143联合作用能抑制DNMT1,DNMT3a和DNMT3b基因的表达；奥沙利铂+miR-143联合作用在CRC细胞中对Bcl-2和caspase-3的表达影响明显强于仅用奥沙利铂处理,提示Bcl-2、caspase-3信号通路是miR-143增加CRC细胞对奥沙利铂敏感性的可能通路。miR-143启动子区多态性与结直肠癌遗传易感性研究目的：初步探讨和研究miR-143启动子区rs4705342T>C多态性与结直肠癌遗传易感性的关系。方法：采用HRM技术,对miR-143启动子区的rs4705342T>C位点进行了基因多态性分析,检测结直肠癌病例组和正常对照组的位点差异。通过Hardy-Weinberg平衡检验,检测病例组与对照组rs4705342T>C多态性的基因型频率；各基因型在病例组与对照组之间分布的差异及等位基因频率的比较采用χ2检验。结果：HRM快速检测了rs4705342T>C各基因型结果显示：TT,TC和CC共3个基因型被检测到。各SNP位点的测序结果与HRM法比较,HRM检测基因多态性的符合率为100%；病例组与对照组rs4705342T>C多态性的基因型频率经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,分别为1.0635和0.929,P值分别为0.3024和0.3351(P>0.05),表明其基因频率达到遗传平衡,具有群体代表性；病例组和对照组中TT、TC. CC基因型的分布总体有统计学差异,P<0.05。C等位基因频率在病例组与对照组中分别为43.60%、57.30%,两者间有显著性差异(P<0.05)。结论：miR-143基因启动子区rs4705342T>C多态性可影响CRC的遗传易感性；rs4705342T>C可作为潜在的CRC易感性生物标志物。图22幅,表4个,参考文献139篇。