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背景和目的树突状细胞(dendritic cells,DCs)是迄今为止体内功能最强大的专职抗原提呈细胞,广泛分布于外周组织中。正常情况下体内绝大多数DC都处于未成熟状态,未成熟的DC可通过其表面受体介导的内吞作用、巨吞饮作用以及吞噬作用等方式摄取抗原,在摄取抗原后或受到某些刺激(如炎性信号LPS、IL-1β、TNF-α)后,未成熟的DC即开始分化成熟。DC的抗原提呈功能可直接或间接激活T、B细胞,因此DC在免疫应答中占据独特地位,对DC的深入研究有助于我们了解机体免疫应答的发生和调控机制,对肿瘤、移植排斥、感染、自身免疫病等发生发展机制及治疗也具有重要的理论意义和实际意义。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是一类结构功能较为明确的模式识别受体,在多种组织和细胞中广泛分布,并且在一些固有免疫细胞如巨噬细胞、DCs中表达较高,TLRs可以通过识别并结合病原体的相关模式分子(pathogen associated molecular pattern,PAMP)来活化免疫细胞并表达一系列的免疫效应分子,在免疫应答和炎症反应中发挥重要作用。尿路感染(urinary tract infection,UTI)是由各种病原体入侵泌尿系统、侵犯尿路黏膜或者尿路组织而引发的尿路炎症,临床特征一般表现为腰痛、尿频、尿急、尿痛,引起泌尿系统炎症的致病菌大部分为肠道的大肠埃希菌。针对尿路感染目前多采用抗生素类药物进行治疗,但随着病原菌耐药性的增加给尿路感染的治疗带来了极大挑战。TcpC是由尿路致病性大肠埃希菌CFT073菌株分泌的一种含有TIR(Toll/interleukin-1 receptor)结构域的蛋白,因其TIR结构域与TLR的TIR结构域结构相似,因此TcpC可以直接与TLR信号通路的接头蛋白髓样分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)结合,从而阻断 TLR 信号通路,干扰机体正常的免疫应答。目前关于TcpC干扰机体免疫应答的研究多集中于巨噬细胞、中性粒细胞以及上皮细胞,尚无TcpC对树突状细胞分化和功能影响的研究报道。本课题组的前期研究发现,TcpC能够抑制DC的分化成熟以及MHC(maj or histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子途径对抗原的提呈。本课题拟研究TcpC调控树突状细胞的作用机制,旨在为进一步阐明TcpC介导的免疫逃逸机制提供新的实验依据。方法1 TcpC蛋白的诱导表达冻融已鉴定好的含TcpC基因片段的工程菌E.coli BL21pET42a-TcpC并划线接种于含卡那霉素的LB固体培养基中,37℃培养箱中培养过夜后从平板上挑取单个分离良好的、直径约为2-3mm的白色半透明菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃220rpm振荡培养过夜。吸取过夜后的菌液1ml并加至含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃ 220rpm振荡培养至OD值为0.6-0.8,加入IPTG,37℃220rpm振荡培养,诱导TcpC蛋白的表达。2 TcpC蛋白的纯化浓缩采用镍柱分离纯化、超滤管浓缩的方法。3兔抗TcpC多克隆抗体的制备将浓缩后的TcpC蛋白与弗氏佐剂及弗氏不完全佐剂等量混合乳化至"油包水"状态,初次免疫之前要先进行耳缘静脉采血作为阴性对照,初次免疫之后的第三周开始加强免疫,每周一次共三次。末次免疫10天后先采少量血进行效价测定。4兔抗TcpC多克隆抗体效价的测定采用双向琼脂扩散的方法进行测定。5兔抗TcpC多克隆抗体的纯化效价达到要求后,对家兔进行颈动脉采血,收集获得的血液并分离血清,再采用饱和硫酸铵法纯化血清中的免疫球蛋白IgG。6兔抗TcpC多克隆抗体的特异性检测Western blotting检测制备的抗体对已纯化的TcpC蛋白以及CFT073菌株分泌的TcpC天然蛋白的特异性,同时用TcpC基因敲除株TcpC-/-作为对照。7检测DCs能否摄取TcpC蛋白收集DC2.4,洗涤后配成3×105 cells/ml铺于Transwell 24孔板的下室,1ml/孔;上室加3×106个细菌(MOI=细菌数:细胞数=10:1)。以3种方式处理:空白对照组,即DC2.4组;DC2.4+TcpCwt组;DC2.4+TcpC-/-组,每组做3个复孔。在不同的时间点收集细胞,裂解细胞并获取胞内蛋白,用制备的兔抗TcpC多克隆抗体进行western blotting检测。8检测TcpC蛋白进入DCs胞内后的作用机制收集DC2.4,洗涤后配成3×105 cells/ml并铺于Transwell 24孔板的下室,1ml/孔;上室加3×106个细菌(MOI=细菌数:细胞数=10:1)。以3种方式处理:空白对照组,即DC2.4组;DC2.4+TcpCwt组;DC2.4+TcpC-/-组,每组做3个复孔。16h后收集细胞,裂解细胞并获取胞内蛋白,用MyD88及p65 磷酸化抗体进行western blotting检测。结果1加入IPTG至终浓度为O.1mM,37℃ 220rpm振荡诱导培养6-7h后TcpC目的蛋白即大量表达,并且主要以包涵体的形式表达。2咪唑浓度为2mM时即可将TcpC蛋白洗脱下来,将纯化后的TcpC蛋白浓度浓缩至2mg/ml并对家兔进行免疫。3采用双向琼脂扩散法测定抗体效价为1:8,对家兔进行颈动脉采血。4 Western blotting检测抗血清对TcpC目的蛋白及天然蛋白均有单一清晰条带,且对照株即TcpC基因敲除的菌株未见条带。5将DCs和细菌transwell隔开共培养不同的时间点检测DCs胞内的蛋白情况,发现共培养8h时DCs胞内即出现TcpC蛋白,随时间变长DCs胞内的TcpC蛋白逐渐增多,至16h时达到最多,20h、24h时又出现减少情况。6将DCs和细菌transwell隔开共培养同时设置对照,发现与CFT073菌株共培养的DCs胞内的MyD88蛋白及p-p65蛋白的量明显低于空白对照组及与敲除株共培养的DCs。结论TcpC蛋白可以被DC摄取,进入DC后可以引起MyD88蛋白的降解并抑制NF-kBp65蛋白的磷酸化,从而干扰TLR信号通路。