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日本血吸虫病是威胁人类健康的主要寄生虫病之一，由日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)感染引起。本实验室前期研究结果发现：SjCa8是日本血吸虫尾蚴和早期童虫的阶段性表达蛋白，分布于尾蚴/童虫的体膜、腺体及分泌物中；重组SjCa8具有免疫原性，且能诱导免疫小鼠产生较明显的抗攻击感染免疫力。结果初步提示SjCa8可能是日本血吸虫尾蚴侵入宿主的关键性分子之一，但其相关机制尚不清楚。本实验以小鼠巨噬细胞株RAW264.7为细胞模型，系统研究了重组SjCa8蛋白对小鼠巨噬细胞的作用。结果显示SjCa8可通过抑制iNOS的表达降低小鼠巨噬细胞NO产量，且这种对NO释放的抑制可能为钙依赖性的。SjCa8还能显著抑制巨噬细胞的迁移及促进巨噬细胞增殖，但对巨噬细胞的形态和凋亡无明显作用。这些结果提示：SjCa8能够下调宿主巨噬细胞NO释放及抑制巨噬细胞迁移，从而降低宿主对尾蚴感染的炎症免疫应答，是具有免疫调节作用的虫源性分子，值得进一步研究。
目的：本实验拟在已有工作基础上，利用小鼠RAW264.7巨噬细胞株，开展了重组SjCa8对小鼠巨噬细胞作用的研究，并初步探讨其相关作用机制，为提示SjCa8在尾蚴侵入宿主过程中的生物学作用提供科学依据。并为SjCa8的进一步研究奠定理论基础。
方法：
㈠rSjCa8的获得：利用基因克隆和重组表达的方法，优化蛋白表达和纯化的条件，获得高质量的纯化rSjCa8。
㈡rSjCa8对RAW264.7细胞的基本生物学作用：①细胞形态观察：分对照组、LPS刺激组、LPS+rSjCa8共同刺激组，采用电镜观察RAW264.7细胞刺激前后的形态和结构变化。②细胞增殖试验：用96孔板培养RAW264.7细胞，并用ConA和rSjCa8分别刺激细胞，并按照CCK8试剂盒的时间和步骤要求，用酶标仪测量细胞的吸光度，并分析各组细胞的增殖情况。③划痕试验：用6孔板培养RAW264.7细胞，细胞贴壁后加入rSjCa8至各种浓度，并同时用针头在孔板的细胞面上划线，荧光显微镜下观察不同时间点细胞划痕的愈合情况，并计数划痕处各组细胞增加数量。④Transwell试验：用Transwell板培养RAW264.7细胞，并在细胞贴壁后加入不同浓度的rSjCa8，20h后取下上室底膜，擦去上层细胞保留下层细胞，固定染色封片，用显微镜观察并计数细胞迁移数量。⑤用75ml的培养瓶培养RAW264.7细胞，设对空白对照组、阳性对照组(使用细胞凋亡阳性对照试剂盒)、rSjCa8组，在细胞生长至70％后分别加入细胞凋亡诱导试剂和不同浓度的rSjCa8，再培育24小时，消化离心收集细胞，加入AnnexinⅤ-FITC和PI，1小时内用流式细胞仪检测。⑥用共聚焦显微镜专用皿培养RAW264.7细胞，设Control组，阳性对照组(使用细胞凋亡阳性对照试剂盒)，rSjCa8组，细胞生长至70％后分别加入细胞凋亡诱导试剂和不同浓度的rSjCa8,培养24小时后，用Hoechst染色液染色，再用激光共聚焦显微镜观察细胞的凋亡染色情况。⑦用共聚焦显微镜专用皿培养RAW264.7细胞，设Control组，阳性对照组(使用细胞凋亡阳性对照试剂盒)，rSjCa8组，细胞生长至70％后分别加入细胞凋亡诱导试剂和不同浓度的rSjCa8,培养24小时后，加入AnnexinⅤ-FITC和Propidium Iodide，1小时内用激光共聚焦显微镜观察凋亡情况。
㈢rSjCa8对LPS刺激下RAW264.7细胞的作用：①将rSjCa8加入到LPS预处理过的RAW264.7细胞中24h，用总一氧化氮检测试剂盒检测细胞上清液中的NO含量；②在LPS刺激24小时的细胞中加入rSjCa8至不同浓度，用一氧化氮绿色荧光探针DAF-AM标记细胞，并用激光共聚焦显微镜实时观察并记录荧光的强度变化。同时将一氧化氮绿色荧光探针DAF-AM和红色钙离子探针Rhod-2 am标记rSjCa8、rSjCa8加LPS以及各种钙离子通道阻滞剂、络合剂、钙池激活剂刺激24h的RAW264.7细胞，并用激光共聚焦显微镜观察拍摄探针的荧光强度。③将一氧化氮供体硝普钠(SNP)加入含有各种浓度的rSjCa8的PBS中，并孵育一段时间，收集各组液体用总一氧化氮检测试剂盒检测各组NO的释放量。④将各种浓度的rSjCa8加入含SNP(3h)的PBS中，并孵育一段时间，用总一氧化氮检测试剂盒检测各组NO的释放量。③将LPS以及LPS+rSjCa8刺激的RAW264.7细胞用Trizol处理并提取总RNA进行NO通路的荧光实时定量PCR芯片检测，并分析结果。选取差异表达基因设计引物进行RT-PCR检测。
结果：⑴SjCa8对巨噬细胞的形态和凋亡无明显影响，但可明显抑制巨噬细胞迁移，并能够促进巨噬细胞的增殖；⑵rSjCa8能够降低LPS诱导RAW264.7细胞产生一氧化氮的水平，表现为细胞上清液中的NO含量减少、细胞iNOS的表达下调，并发现该作用可能与RAW264.7细胞内钙离子浓度相关；⑶在LPS刺激下，RAW264.7细胞的过氧化氢酶(catalase)表达量下调，而rSjCa8能够拮抗LPS的这种作用，表现为RAW264.7细胞catalase表达明显上调。
结论：日本血吸虫尾蚴分泌蛋白SjCa8具有抑制宿主巨噬细胞的迁移及NO释放的免疫学功能。提示了SjCa8是一个免疫调节分子，值得进一步研究。