土壤盐渍化是一个全球性问题,对生态环境和农业生产带来了巨大的负面影响。盐胁迫导致植物生长发育迟缓,由此引发多种生理反应。植物形成各种生理、细胞和遗传机制使其在高盐胁迫下得以生存,其中包括SOS（Salt overly sensitive）系统、植物激素、抗氧化防护系统、渗透调节物质和膜脂信号等。植物磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）是磷脂代谢和应答非生物胁迫的重要酶类。PLD及其水解产物磷脂酸（Phosphatidic acid,PA）参与多种胁迫反应。因此,揭示PLD和PA调控植物耐盐的分子机制,对研究植物应答高盐胁迫和农作物抗逆分子遗传改良具有重要的意义。拟南芥基因组有12个PLD基因,根据蛋白结构和催化区域,分为PLDα（3）、PLDβ（2）、PLDy（3）、PLDδ、PLDε 和 PLDζ（2）。其中,PLDα1 和 PLDδ含量最多。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,研究PLD和PA对植物激酶蛋白PINOID（PID）活性的调控,及其对耐盐性的影响。主要研究结果如下:我们利用Western blotting验证了pld突变体材料的可用性,包括plda1、pldδ-1、pldδ-2、pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2。利用3H标记的PC（磷脂酰胆碱）和专一性的酶反应缓冲液,测定了野生型（WT）和pld体内的PLDα1和PLDδ活性。结果表明:pld单突变体中PLD蛋白的活性显著低于WT,pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2双突变体中PLD活性最低;用125 mM NaCl处理WT幼苗3 min后,PLD总活性（PLDα1和PLDδ）开始升高,5分钟达到最高,而后随着处理时间的延长（30分钟开始）,其活性开始下降;同时,利用ESI-MS/MS技术测定拟南芥磷脂组分。结果表明:盐处理10 min后,WT总PA含量显著升高,其中主要包括分子种34:2 PA、34:3 PA、36:4 PA、36:5 PA 和 36:6 PA,而pldα1 pldδ-1中无显著变化。利用 125 mM NaCl 处理WT和pld突变体幼苗,7天后统计主根根长发现:NaCl显著抑制WT和pld单突变体主根伸长,其对pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2的抑制最严重;外源PA能够在一定程度上恢复pld突变体主根生长。上述结果表明,PLD和其产物PA参与拟南芥主根耐盐的调控。PA通过结合靶蛋白,调控其细胞定位、活性或下游靶基因表达,调节植物对高盐、高温、冻害和渗透胁迫等多种逆境的响应。为了确定PA是否与PID蛋白激酶结合,我们从拟南芥中克隆了 PID的CDS区域和其三个截断,并将其连接到带有His标签的表达载体pET-28a（+）上,在大肠杆菌中诱导重组蛋白表达并纯化。利用脂印迹（Fat-blot）实验技术发现PA特异性与PID蛋白结合,其结合区域位于1-228氨基酸片段;结合定点突变技术进一步确定了 PID中第119-121位的三个赖氨酸（KKK）是PA的结合的关键位点。PID通过磷酸化质膜PIN蛋白调控其活性、极性分布。我们比较了盐胁迫对质膜上PID和PIN2丰度的影响。125 mM NaCl处理6 h显著降低质膜中PID-GFP（ProPID:PID-GFP）和PIN2-GFP（ProPIN2:PIN2-GFP）的丰度;而pldα1 pldδ-1 中二者丰度降低更多;外源添加25 μM PA处理显著缓解盐效应。同时,我们将PID和PA的结合关键位点KKK突变为GGG,获得了pid-1的野生型回补（ProPID:PID-GFP,pid-1）和突变体回补（ProPID:mPID-GFP;pid-1）等材料并进行盐处理。125 mMNaCl处理后,与野生型回补相比,突变体回补膜上荧光值降低的更多;外源添加PA能缓解野生型回补材料膜上PID丰度,而对突变体回补无显著效果。上述结果表明,盐胁迫能通过某种机制抑制质膜PID和PIN2的蛋白丰度,而PLD/PA能够促进二者的稳定性,并且其可能依赖于PA-PID的互作。我们用125 mM NaCl处理WT、pid突变体（pid-1和pid-2）及pid-1回补等材料6天后,比较各遗传材料根发育的差异。结果表明,与WT相比,在主根伸长方面,pid突变体表现为盐超敏感表型。野生型回补材料ProPID:PID-GFP pid-1恢复到野生型水平,而突变体回补中,盐胁迫下其主根表型与pid-1无显著差异。外源PA处理有效缓解 WT 和 ProPID:PID-GFP;pid-1主根长度,而对pid-1和ProPID:mPID-GFP;pid-1无显著影响。另外,pid-1突变体会形成针状花序、异常花和异常子叶,其中三个子叶是最常见的表型;其根向重力性降低。我们结果表明,与WT相比,野生型和突变PID转基因能够均能恢复其发育表型和向重力性。上述结果暗示,PA-PID互作特异性调控PID应答高盐胁迫,其可能不参与调控其他发育过程。脂印迹实验发现PA可以结合PIN2蛋白的胞质部分PIN2CL,其结合位点位于第496位精氨酸氨和第497位的赖氨酸。我们构建了pin2-1野生型回补材料（ProPIN2:PIN2;pin2-1）和结合位点突变的回补材料（ProPIN2:mPIN2;pin2-1）,并进行盐胁迫处理。结果表明:125 mM NaCl处理后,与WT相比,pin2-1和pin2-2突变体在主根生长方面均表现为盐超敏感表型,且外源添加PA不能恢复其表型;进一步研究发现ProPIN2:PIN2;pin2-1和ProPIN2:mPIN2;pin2-1回补材料的表型均与WT一致。上述研究结果表明,在盐信号过程中,PIN2处于PLD/PA信号的下游,且PA-PIN2的互作可能没有直接参与植物耐盐性的调控。我们利用蛙卵异源表达技术进一步研究了 PA对PID介导的PIN2活性的调控作用。单独表达PIN2的细胞并没有检测到生长素转运,而同时表达PID和PIN2检测到生长素的外向转运活性,表明PIN2的转运活性依赖于PID磷酸化。外源PA显著提高PIN2的转运活性,而当只表达PIN2蛋白时,PA无明显作用。同时,PC对PIN2的生长素转运活性无调控作用。另外,当共表达与PA不结合的PID和PIN2时,PA促进PIN2转运活性的效应消失。利用生长素标记材料DII-VENUS,观察了不同遗传材料根尖分生组织生长素的实时变化。当DII-VENUS荧光升高,表示生长素含量下降,反之则升高。对照条件下,与WT相比,pldα1 pldδ-1,pid和pin2根尖分生组织生长素含量较高;125 mM NaCl处理后,WT根尖分生组织DII-VENUS荧光升高,生长素下降,而pldα1 pldδ-1,pid-1和pin2-1基本不变;外源补充的PA,促使WT和pldα1pldδ-1根尖分生组织荧光升高,生长素更低,而pid和pin2的荧光无显著变化。另外,观察了回补材料 ProPID:PID-GFP;pid-1 和 ProPID:mPID-GFP;pid-1背景下DII-VENUS的荧光变化,结果表明:对照条件下,它们的荧光和WT无显著区别;NaCl处理后,ProPID:PID-GFP;pid-1和WT根尖分生组织DII-VENUS荧光值相近,而ProPID:mP1D-GFP;pid-1和pid-1突变体荧光值一致。上述结果表明,PA-PID互作参与调控植物根尖生长素的动态分布和高盐应答过程。综上所述,盐胁迫下,PLDα1和PLDδ被激活,产生信号分子PA,结合并激活PID磷酸化PIN2的活性,提高质膜PIN2转运生长素的活性,促使生长素的动态再分布和植物的盐应答。本研究揭示了一条基于磷脂信号调控生长素信号转导和植物应答高盐胁迫的分子机制,为后期农作物的耐盐分子遗传改良提供了重要的理论基础和基因资源。