肝素酶是一类多糖裂解酶，肝素酶Ⅱ是来源于肝素黄杆菌的三种肝素酶中唯一能同时裂解肝素和硫酸乙酰肝素的酶类。本研究以肝素黄杆菌基因组DNA为模版，扩增出肝素酶Ⅱ基因，将其克隆到带有His6标签的pET22b载体，转化到BL21(DE3)后，在大肠杆菌中进行低温诱导表达，约90％的融合蛋白以可溶性形式表达，通过Ni-NTA亲和纯化获得电泳纯。　　 纯化所得重组肝素酶Ⅱ(HepⅡ)的酶学性质如下：最适温度30℃，最适pH8.0。Ⅱ重组HepⅡ对热不稳定，在30℃保温30 min，残余酶活性为60％以上，但在45℃保温.30min后酶完全失活。pH7.0～8.0的范围内酶活能够保留60％以上。实验结果表明：NaCl对酶活有抑制作用，且400 mM的NaCl将完全抑制酶活性，而Ca2+对HepⅡ有较强的激活作用，且酶活随Ca2+浓度的提高而增加，GPC-HPLC结果也进一步表明了Ca2+对HepⅡ的激活效应。为了确定Ca2+在HepⅡ的结合位点，通过位点能量优化及定点突变等实验技术，确定了Asp307，Val308，Asp309，Tyr310为重组HepⅡ的Ca结合位点，为肝素Ⅱ的结构与功能研究以及重组肝素酶Ⅱ的高活性表达奠定了基础。　　 本课题对重组HepⅠ的表达纯化及性质也进行了相关的研究，有助于进一步进行低分子肝素的制备。