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研究目的:针对光生物调节作用(Photobiomodulation,PBM)疗法治疗糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcers,DFUs)所存在的光参数混乱和生物效应不清楚的问题,采用400-900nm范围内的多个波长LED光源对DFU愈合相关细胞进行光参量差异对比研究和细胞生物学研究,并在动物水平进行在体验证,为DFU的PBM治疗提供理论基础和光参量配伍的可靠证据,从而推进PBM治疗DFU的临床应用。研究方法:(1)高糖和正常培养的4种与DFU愈合相关的关键细胞(皮肤成纤维细胞WS1、血管内皮细胞HUVEC、巨噬细胞U937和角质形成细胞HACAT)接受12个波长(405nm、425nm、455nm、495nm、510nm、530nm、560nm、630nm、660nm、730nm、805nm 和 850nm)、2 个功率密度(10 和 40mW/cm2),7 个能量密度(0.5、1、2、4、6、8、10 J/cm2)组合的共168组PBM照光方案。MTT法检测细胞增值率,筛选4种糖尿病溃疡愈合效应细胞的最佳照射波长和光剂量。(2)采用上述筛选出的最佳照射波长和光剂量PBM治疗后,检测正常培养和高糖培养下4种细胞内ATP水平的变化,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6、ICAM-1的浓度,评价PBM对细胞功能的影响;细胞划痕实验评价PBM对细胞迁移能力的影响。(3)2型糖尿病(T2DM)大鼠构建DFU模型,接受上述筛选出的最佳照射波长和光剂量PBM治疗。记录创面愈合情况,计算创面面积收缩率,激光散斑测量PBM治疗过程中创伤局部血流的变化,HE染色、MASSON染色和免疫组织化学染色对伤口组织进行组织病理学评价。研究结果:(1)PBM可促进正常和高糖培养的HACAT、WS1、HUVEC、U937细胞增殖,与PBM的波长、能量密度、功率密度以及培养糖浓度有依赖关系。整体来看,PBM对细胞生长的影响呈现低剂量增殖效应,在0.5-4 J/cm2增殖作用达到高峰。低功率密度PBM促进细胞生长效应优于高功率密度。与常规培养相比,HACAT、WS1、HUVEC细胞在高糖培养时PBM效应波长“蓝移”。初步筛选最佳PBM参数并拟定于后续实验中继续研究:波长425nm、510nm、630nm、730nm、850nm,功率密度 10mW/cm2,能量密度 0.5-4J/cm2。(2)在高糖模型中,PBM促使WS1细胞、HACAT细胞、HUVEC细胞内ATP水平升高(P<0.05),对U937细胞内ATP无显著影响(P>0.05);PBM可促进WS1细胞分泌IL-1β,对其分泌IL-6和ICAM-1无显著影响(P>0.05);PBM可促进 U937 细胞分泌 IL-1β、ICAM-1(P<0.05),抑制其分泌 IL-6(P<0.05);PBM促进HUVEC细胞分泌IL-1β(P<0.05);同时PBM促进WS1、HACAT细胞迁移。(3)425nm、630nm、730nm、850nm和联合照光治疗PBMT均有直接促进T2DM大鼠伤口愈合的作用,愈合时间较对照组缩短。其中,PBM630组和PBMcom组效果最为突出。PBM630、PBM730和PBM850组大鼠照光侧伤口血流量增加(P<0.05)。病理检查表明PBM治疗组大鼠伤口表现出伤口血流增加、上皮延伸加快、细胞增殖明显(HE染色)、胶原沉积增加(MASSON染色)、新生血管生成增多(CD31)、早期炎症细胞聚集增加(CD11b)、炎症持续状况改善、基质金属蛋白酶(MMP9)表达减少等组织病理学表现。结论:参与糖尿病溃疡愈合的不同细胞对PBM的生物学响应呈现复杂性,不同细胞的最佳PBM光参量不同,应用时应该多波长配伍进行治疗。PBM对大鼠糖尿病足溃疡的愈合有明显的促进作用,425、630、730、850和联合照光治疗(COM)均有直接促进伤口愈合的作用。PBM可能通过促进糖尿病伤口再上皮化,促进伤口细胞增殖,纠正血管发生迟滞,改善伤口血液循环,促进炎症细胞聚集,改善炎症持续状态,促进胶原沉积,减少基质金属蛋白酶活性,促进T2DM大鼠伤口愈合。