胚胎发育相关基因—EDAG的诱导表达及蛋白纯化

来源 :中国协和医科大学 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:goodcat13579
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胚胎发育相关基因(EDAG)是新近发现的造血相关基因,该基因定位于染色体9q22,是从4月龄人胚胎组织与成年肝组织的差异基因ETS库中分离得到的。EDAG基因在人体内的表达具有时空依赖性:在造血活跃的组织如胎肝、成人骨髓中高表达,同时也高表达于CD34+细胞及人白血病细胞系K562中。研究表明EDAG具有恶性转化活性,与维持细胞的未分化状态有关。最近的转基因小鼠研究表明,在小鼠造血细胞中过表达EDAG可导致造血干细胞增殖分化紊乱。突出表现在髓系造血增强,淋巴系造血抑制,并出现典型的髓系增生综合症,提示EDAG是一种参与造血组织发育与分化调控的重要基因。 迄今为止,EDAG调控造血细胞增殖、分化及凋亡的分子机制尚不明确。鉴于EDAG是一种新发现的基因,目前既无商品化的蛋白亦无抗体用于其蛋白水平的研究。成功的构建了带有His标签的pET22b-EDAG及pET28a-EDAG融合表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导出蛋白的表达。同时通过反复的摸索确定出适合pET22b-EDAG/BL21(DE3)组合的最佳表达温度和IPTG浓度,并筛选出了两株表达较高的单克隆。并且确定了纯化条件,最终纯化出EDAG蛋白。最后用抗His抗体作WesternBlot鉴定,结果证实纯化出的单一条带确实为诱导表达的EDAG蛋白。这为进一步制备EDAG抗体,检测该基因在组织、细胞中蛋白水平的表达,从而了解其功能和作用机制奠定了基础。
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