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小麦是人类重要粮食作物之一,低温胁迫对作物影响巨大。东农冬麦1号（Dn1）作为北方高寒地区首例能安全越冬的栽培品种,有着重要抗寒相关长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）资源。MicroRNA（miRNA）与冬小麦抗寒性密切相关;寒胁迫相关miRNA可以通过结合靶基因的mRNA而导致基因沉默,从而启动冬小麦的抗寒应答机制。植物miRNA在各种逆境应答中发挥重要作用,lncRNA可作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）,竞争性结合miRNA共同控靶基因的表达。miRNA与lncRNA两者有着密切的互作关系,但目前lncRNA介导的ceRNA调控冬小麦抗寒机制的研究尚无报道,开展相关研究工作十分必要。本研究以Dn1分为试验材料,在大田自然降温条件下,分别于5°C、-10°C和-25°C三个不同低温下取材分蘖节,采用HiSeq技术进行RNA-seq测序,测序所得片段经长度经统计分析后进行ORF、Rfam、CPC数据库比对筛选以及去除重复序列,找到三个温度点的所有lncRNAs,并对其进行家族分析,构建三个温度下lncRNA表达谱,然后进行lncRNA差异分析,并构建lncRNA差异表达谱;在Wenn分析的基础上筛选出差异表达极显著的120条lncRNA,进行与miRNA的互作预测,将得到可能互作的miRNA进行靶mRNA预测。为构建抗寒相关lncRNA-miRNA-靶mRNA的调控互作网络,运用Cytoscape软件整合所得RNA。选择出前期研究中具有抗寒表达的miR398进一步在lncRNA-miRNA-靶mRNA的调控互作网络的基础上,形成lncRNA-miR398-靶mRNA调控网络,并对lncRNA-miR398-靶mRNA进行互作验证及相关lncRNA的表达分析。通过克隆lncRNA构建过表达载体,转于模式植物中进行低温处理检测相关RNA表达量初步验证其lncRNA调控miR398的抗寒功能。主要研究结果如下:1.Dn1中lncRNA测序数据处理及统计分析采用HiSeq技术进行高通量测序得到RNA片段长度在200至4656 nt之间（其中77.7%以上）小于1,000 nt,获得5°C、-15°C、-25°C三个温度下的clean reads总量分别是65,483,181、67,567,197和61,436,657。这些lncRNAs在Dn1的染色体上分布均匀,无明显位置偏好,且覆盖深度较全面。将比对到染色体上的reads,注释到exonic（外显子）、intronic（内含子）、intergenic（基因间区）上。我们发现比对上exonic（外显子）的reads含量较高,可达81.05%-86.83%,比对到intronic（内含子）的reads最少,在2.33%-3.27%。使用Cufflinks进行组装统计各个样品的新转录本的数目及计算新转录本的表达量,发现-10°C中的New transcript得到的数量最高,平均为13875,-25°C中New transcript得到的数量最少,为12328。3个温度样品间检测到基因的平均数表现为5°C>-10°C>-25°C,即5°C时转录本的丰度最高。2.在低温胁迫下Dn1中lncRNA鉴定及差异表达分析利用生物信息学的手段筛选鉴定出了9971条高度可信的Dn1候选IncRNA。分蘖节中的一些lncRNA对低温胁迫表现出不同的应答。在-10°C下,有1260个lncRNAs显著差异表达,其中591个上调表达,669个下调表达;而-25°C下有l382个lncRNAs表达差异显著,其中1539个上调表达,3843个下调表达。此外,-10°C与-25°C相比,在-25°C库中共有5072个lncRNAs差异显著表达,其中1378个上调表达,3694个下调表达。三个温度下表达水平同时发生变化的共有471个lncRNAs,利用qRT-PCR方法对筛选出的部分lncRNA的表达进行了验证,两者结果基本一致。3.筛选抗寒相关lncRNA-miRNA互作网络构建及功能预测挑选出在-10°C与-25°C下表达差异极显著的120个lncRNA（上下调各60）,通过lncRNA与miRNA互作筛选软件miRanda、PITA及RNAhybrid进行筛选,将三个软件的交集共得到的lncRNA与miRNA的预测结果作为本实验的验证基础。预测所得到的miRNA共80条,并对相关miRNA进行靶mRNA的预测,应用Cytoscape生物信息学软件将miRNAs-靶mRNAs的关联与miRNA-lncRNA的关联整合进行联合分析,构建出各个RNA间可能的调控关系。为研究lncRNAs和tae-miRNA的潜在功能,将靶向作为miRNA与抗寒相关lncRNAs相互作用的靶mRNA的基因进行GO分析,以分析在Dn1低温诱导下可能发挥的生物学功能。结果显示,lncRNA可能参与信号转导、能量合成、分子代谢、解毒、转录和氧化还原等生物过程。本研究表明,lncRNA可通过调控蛋白质编码基因参与调节植物响应和适应寒胁迫。4.抗寒相关lncRNA-miR398-靶mRNA的互作网络构建及表达分析挑选与tae-miR398互作的抗寒相关lncRNA,形成lncRNA-miR398-靶mRNA互作网络。运用RACE及RAP技术,验证miR398与其靶mRNA（TaCSD1）及其相互作用的3条lncRNA:TRAES7AS9A759DD28.1（lncR9A）、TRAES3BF117100150CFDt1（lncR117）和TRAES3BF061600100CFDt1（lncR616）间的互作关系。（1）5’RACE结果证明TaCSD1是tae-miR398的靶基因,并且被tae-miR398所切割,切割位点位于编码区,分别在tae-miR398与靶基因互作位点下游110 bp位置。RAP验证ceRNA间的互作结果表明:lncRNA（lncR9A、lncR117和lncR616）可作为ceRNA,调控tae-miR398与TaCSD1在低温胁迫下的协同作用。lncR9A、lncR117和lncR616在RNA水平参与调控TaCDS1与tae-miR398。（2）成功克隆得到与tae-miR398互作的3条lncRNA基因:lncR9A、lncR117和lncR616,分别构建获得3个表达载体,形成3个重组质粒（pCAMBIA3300sU-tae-lncR9A,pCAMBIA3300sU-tae-lncR117,pCAMBIA3300sU-tae-lncR616）;浸花法侵染转化拟南芥,筛选阳性植株,收获T1、T2代种子。对T2植株进行低温处理（0 h空白菌液侵染为对照）,4°C3 h→-10°C 5 h→4°C 3 h→正常培养5 d后取叶片,real-time PCR检测,结果表明,与野生型相比lncR9A、lncR117及lncR616的转基因拟南芥及其低温胁迫的叶片中,RNA的表达情况不同:miR398整体表现出下降趋势,且靶基因CSD1与miR398表现出相反的趋势。（3）选择lncR9A的重组质粒转化禾本科模式植物二穗短柄草,抗性筛选获得T2代种子。对T2代植株低温处理（0 h空白菌液侵染为对照）,4°C 3 h→-10°C 5 h→4°C 3 h→正常培养5 d后取叶片qRT-PCR检测,结果表明经低温处理后,CSD1表达呈上升趋势,而miR398表达呈现下降趋势。LncR9A与miR398及靶mRNA（CSD1）都能够响应低温胁迫,且在低温处理下的表达趋势不同,相互协调。通过以上实验初步形成miR398与lncRNA及靶基因CSD1之间的复杂生物调控网络,miR398能调控其靶基因CSD1启动抗寒应答,并且被lncRNA竞争性地结合而调控靶基因CSD1的表达,进而影响Dn1的抗寒性。该研究为Dn1中miR398的调控机制研究提供了新思路,同时miRNA-lncRNA能够影响植物的形态及生长发育过程,可为农作物的种植提供理论指导。