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目的 恶性实体肿瘤中心乏氧区肿瘤细胞对放疗、化疗的耐受性是导致治疗失败的重要原因之一。本研究拟构建一种由缺氧反应元件（hypoxia responsive element，HRE）调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）基因的真核表达载体，观察HRE能否增强HSV-TK／丙氧鸟苷（gancyclovir，GCV）系统对乏氧环境中的人Ewing肉瘤细胞系（SK-ES-1细胞）的杀伤作用，为弥补放、化疗的不足探索有效的治疗方法。 方法 1 将化学法合成的HRE片断，插入到空载体（pIRES2-EGFP）的双顺反子荧光蛋白报告基因的真核启动子的增强子部位，按插入片段上下游载体序列合成引物1、2，以PCR方法筛选含HRE片断的阳性克隆，测序鉴定，获得重组质粒pHRE；用引物3、4，以PCR法扩增TK基因片断，将其克隆到pIRES2-EGFP及pHRE的双顺反子荧光蛋白报告基因上游的多克隆位点，用PCR筛选含单拷贝正向插入TK片段的阳性克隆，测序鉴定，获得重组质粒pTK及pHRE-TK。 2 用阳离子脂质体将pHRE-TK、pHRE、pTK及pIRES2-EGFP导入SK-ES-1细胞，分别在乏氧（O2浓度为3％）和富氧（O2浓度为21％）环境中培养16小时，荧光显微镜观察报告基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表达变化，进行荧光光密度分析；再予以GCV处理上述质粒转染细胞5天后，用四唑盐法（MTT法）检测GCV对SK-ES-1细胞的杀伤效果。 结果 1 测序结果证实：重组质粒pHRE含HRE片断，序列正确，且为单拷贝正向插入；重组质粒pTK及pHRE-TK均含单拷贝正向插入的HSV-TK片断，序列正确。 2 对比各组SK-ES-1细胞EGFP荧光光密度值发现：①在乏氧环境中培养，pHRE组和pHRE-TK组细胞荧光光密度值显著高于富氧环境培养组的荧光光密度值，p＜0.01；②在乏氧环境培养下，pHRE组和pHRE-TK组细胞荧光光密度显著高于pTK组和空载体组，p＜0.01；③在富氧环境培养的各组细胞之间荧光光密度无显著差异。第三军医大学硕士学位论文 3对比GCV对各组SK一ES一1细胞杀伤效果发现:①在乏氧、富氧两种环境培养的pHRE一TK和pTK组细胞对GCV的敏感性均明显高于pHRE组细胞，p<0.01，其敏感性随GCV浓度增加而增强;②在乏氧环境培养的pHRE一TK组细胞对GCv的敏感性明显高于pTK组，p<0.01，而在富氧环境中，pHRE.TK组与pTK组无显著性差异;③在乏氧环境培养的pHRE一TK组细胞对Gcv的敏感性明显高于在富氧环境中培养的pHRE一TK组细胞，p<0.01;而在乏氧、富氧两种环境培养的pTK组细胞对GCV的敏感性无显著差异。 结论 1成功地构建了含有HRE及HSV-TK基因片断的真核表达载体; 2 HRE显著增强HSV-T刃GCv对乏氧环境中EWing肉瘤细胞的杀伤效率。