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阿尔茨海默病(AD)是一种以记忆和认知功能障碍为主要症状的中枢神经系统变性疾病,是老年痴呆的常见类型。由于AD病因还不是很清楚,目前国内外还没有疗效好而无副作用的特效药物问世。但是有很多遗传学和生物化学证据表明,在大脑中相互聚集的Aβ是发病过程中的关键物质。动物试验揭示,无论是主动免疫还是被动免疫均能有效减少转基因鼠脑内主要由Aβ相互聚集形成的纤维构成的淀粉样变的量,并且逆转记忆损伤。因此,针对Aβ的免疫治疗将是一种非常有前景的治疗AD的方法。 本课题方案是根据Aβ分子的结构特点,设计两种可识别Aβ纤维的多肽序列,与人IgG抗体的Fc段重组,构成人源化的融合抗体,并应用酵母表达体系表达制备。该抗体具有类似天然抗Aβ抗体诱导巨噬细胞清除斑块的功能,并且由于其Fc段为人源,不会引起人体的炎症反应,对AD的研究和治疗具有潜在的理论和应用价值。为了鉴定这种融合抗体是否能够在体内发挥作用,我们需要表达制备含有小鼠Fc段的融合抗体,并将抗体注射入转基因小鼠(APP695)体内,观察该融合抗体在体内的作用效果。 前期工作中,我们已经构建了含有目的基因的单拷贝表达载体PAO815AFc。经酶切鉴定正确后,将质粒用BglⅡ酶切线性化转入GS115酵母菌株。两种融合抗体各挑取18个转化子进行小量表达,并用SDS-PAGE鉴定其产物,两种融合抗体分子量均约为30KD。经初步筛选,A1Fc得到阳性表达菌株14株,A2Fc得到16株,阳性率分别为78%和89%,其表达单位具有良好的遗传稳定性。为进一步提高产量,分别从两种融合抗体菌株中挑选一株表达量较高的进行表达和培养条件的优化。经过对培养时间、甲醇加入浓度、诱导酵母菌密度的条件摸索,实现了融合抗体的高效表达和分泌,目的蛋白占分泌蛋白总量的90%以上,两种融合抗体菌株诱导上清液中融合抗体的表达量均达到50mg/L,得到表达上清后,用Protein A亲和层析柱进行纯化后,融合抗体纯度可达95%以上,纯化回收率为60%,最终产量为30mg/L。 鼠源融合抗体经Western-blot鉴定抗原性正确,其分子量以及N-段序列与预期