论文部分内容阅读
长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸、不具有传统开放阅读框、以RNA形式发挥生物学功能的调控分子。随着RNA测序技术的发展和lncRNA相关功能机制研究的深入,成千上万的lncRNA被陆续发现,并被证明在多种生理病理状态下发挥着重要的调控作用。由于种类的多样性和功能机制的复杂性,lncRNA领域仍有大量问题亟待解决。最近的研究表明,lncRNA是中枢神经系统的关键调控因子。然而,目前尚不清楚它们在小脑中具有怎样的功能。小脑肽1（Cerebellin-1,Cbln1）是主要表达于小脑颗粒细胞的突触组织者蛋白,在小脑突触的完整性和可塑性中起着至关重要的作用。尽管它在小脑共济失调疾病中具有重要的功能和治疗潜力,但到目前为止,Cbln1的基因表达调控仍有待阐明。本研究通过对lncRNA Gm2694异构体的功能进行检测,发现在受检的5个剪接异构体中,只有Gm2694-204（称为 lncRNA-Promoting Methylation,lncRNA-PM）对Cbln1 mRNA 的表达发挥正向的调控作用。对小鼠出生后小脑四个关键发育节点和不同脑区的反转录荧光定量 PCR（Reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR）检测显示,lncRNA-PM与Cbln1具有一致的时空表达模式。荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）实验发现lncRNA-PM主要表达在小脑的颗粒细胞的细胞核中。机制上,通过在神经瘤母细胞（Neuro2a cell）中进行的敲低或过表达、双荧光素酶报告实验、核质分离、FISH、免疫荧光和染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）等一系列实验证明出IncRNA-PM通过募集 Pax6（Paired box 6）-Mll1（Mixed lineage leukemia 1）复合物到 Cbln1的启动子上游调控区域,促进组蛋白修饰H3K4me3（Trimethylation of lysine 4 on histone 3）进而正向调控Cbln1基因的转录。小鼠小脑样本UV-RNA免疫沉淀（UV-RNA immunoprecipitation,UV-RIP）、re-ChIP 和 RNA 纯化染色质分离（Chromatin isolation by RNA purification,ChIRP）实验揭示在体内IncRNA-PM能够和Pax6-Mll1复合物共同结合于Cbln1基因的启动子上游调控区域。生物学功能上,本研究通过FISH、免疫荧光、突触电镜图像和运动行为学实验,证实病毒注射诱导的小脑IncRNA-PM敲低模型小鼠在Cbln1的表达、小脑突触完整性和运动功能方面都存在明显的缺陷。总之,本项工作揭示了细胞类型特异性表达的lncRNA剪接异构体介导的通过Pax6-Mll1-H3K4me3通路调控的Cbln1转录激活机制,并为lncRNA在小脑中的重要功能提供了新的见解。