DAB2IP表达载体的构建及其对前列腺癌细胞LNCaP DNA合成及凋亡的影响

来源 :辽宁医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lkh007
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目的构建表达载体pEGFP-N1-DAB2IP,观察DAB2IP在前列腺癌细胞LNCaP中高表达后对其DNA合成及凋亡的影响。方法根据前列腺癌相关基因DAB2IP的序列,设计引物,提取前列腺癌细胞系(LNCaP)总RNA,通过PCR扩增DAB2IP基因全长。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后T4DNA连接酶连接pEGFP-N1,DH5α转化后,培养提取质粒,用酶切及测序签定来确定构建的质粒正确。用对照载体pEGFP-N1和pEGFP-N1-DAB2IP转染前列腺癌细胞LNCaP,荧光显微镜下观察转后荧光蛋白表达,转染48小时后Western blot检测DAB2IP蛋白的表达,应用BrdU/PI掺入法检测DAB2IP对细胞DNA合成的影响,应用Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染法检测两组细胞凋亡情况。结果pEGFP-N1-DAB2IP表达载体经酶切电泳和DNA测序鉴定正确,并成功转染LNCaP细胞。Western blot显示转染后pEGFP-N1-DAB2IP组较pEGFP-N1组的DAB2IP蛋白表达水平明显升高。BrdU/PI掺入法检测显示pEGFP-N1组BrdU+细胞对比pEGFP-N1-DAB2I-P组BrdU+细胞差异有统计学意义(P<0.05),提示DAB2IP能抑制LNCaP细胞的DNA合成。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法转然后pEGFP-N1组与pEGFP-N1-DAB2IP凋亡细胞数相比组差异有统计学意义(P<0.05),提示DAB2IP能诱导前列腺癌细胞LNCaP的凋亡。结论1、本实验运用逆转录技术成功克隆了人类DAB2IP基因。2、成功构建重组质粒表达载体pEGFP-N1-DAB2IP,表达载体成功转染前列腺癌LNCaP细胞。3、DAB2IP的过表达能抑制了LNCaP细胞DNA的复制,并以此调控细胞增殖;DAB2IP的过表达能诱导LNCaP细胞凋亡。
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