癌症是威胁人类生命健康的元凶之一,其中乳腺癌是在女性中最高发的恶性肿瘤之一。化学药物在癌症的术前和术后治疗中都发挥着重要作用,随着近年来新药研发的不断加快,多类药物被开发用于癌症的综合治疗,且疗效评估显著。白藜芦醇作为天然的植物多萜类化合物能清除体内的活性氧自由基,起到抗氧化、抗衰老的功能。研究表明,白藜芦醇对于多种癌细胞具有损伤作用,这使得白藜芦醇作为协同治疗药物用于联合治疗乳腺癌具有广泛的潜力。为了系统分析白藜芦醇对于癌细胞的毒性效果和抗癌的分子机理,本研究以小鼠乳腺癌细胞系(4T1细胞)为主要的研究对象,从细胞和分子水平探究白藜芦醇(Resveratrol,RSV)对细胞形态、细胞活性、细胞增殖、细胞凋亡、坏死、和细胞周期的影响。本文主要的研究结果如下:(1)RSV对于不同细胞系的增殖和活性的影响:用不同浓度的RSV(0、50、100、150、200和250μM)分别处理正常细胞系(人正常肾小管上皮细胞HK-2和人正常肝细胞L02)和癌细胞系(小鼠乳腺癌细胞4T1和人肝癌细胞HepG2)24 h、48 h和72 h,CCK-8试剂盒检测细胞活性的变化情况。结果显示:低浓度、短时间的RSV处理对于正常的细胞系有轻微的促进作用;随着处理时间和处理浓度的增加,RSV对于正常细胞系和癌细胞系均存在着明显的抑制作用。通过比较活性发现,RSV对于癌细胞系的作用效果明显高于正常细胞系,尤其对于4T1细胞系的抑制作用最为强烈。所以选取4T1细胞系为研究对象进行增殖和活性分析,RSV以时间和剂量依赖性的方式抑制4T1细胞的增殖,由增殖曲线计算出RSV在48 h对4T1细胞的半抑制浓度(half inhibitoryconcentration,IC50)为93.09μM≈93μM。(2)RSV对4T1细胞形态学的影响:不同浓度分别处理4T1细胞24 h、48 h和72 h,倒置显微镜观察的细胞形态变化情况显示:对照和低浓度RSV处理情况下,细胞的贴壁效果明显,细胞的增殖与生长状况良好;随着RSV处理浓度的增加,细胞的贴壁生长受到抑制,细胞体积膨胀,细胞边缘模糊,细胞膜破裂,并且计算出绝大多数的细胞面积也随之减小,由此导致生长环境愈加恶劣,从而加速细胞死亡。综上,根据死亡形态推测4T1细胞的死亡是由凋亡诱导的。(3)RSV对4T1细胞凋亡和细胞坏死的影响:不同浓度白藜芦醇处理4T1细胞24 h、48 h和72 h后,用AO/EB试剂盒配合荧光倒置显微镜检测细胞的形态学凋亡,计算细胞凋亡率后发现100μM左右的RSV能够使大概一半的细胞发生凋亡或者死亡,这与之前CCK8检测的IC50的浓度大致相符合。Annexin-V/PI试剂盒结合流式细胞仪的检测结果表明RSV以时间和浓度依赖性的方式诱导4T1细胞系的凋亡致死。(4)RSV对于4T1细胞基因表达的影响:采用RNA-seq配合转录组学分析筛选RSV处理组和无处理对照组之间的差异表达基因(DEGs),总共鉴定出330个表达量具有显著性差异的基因,其中相对于对照组上调的有103个,而相对下调的有227个。GO注释分析和KEGG通路富集分析的结果表明DEGs主要富集在细胞周期、细胞分裂和细胞黏附等相关通路。qRT-PCR验证结果显示,绝大多数差异基因的表达趋势与RNA-Seq测序结果一致,RSV可能主要是通过调节周期相关基因的表达发挥对于癌细胞的毒性作用。(5)RSV对于4T1细胞周期的影响:通过构建RSV的靶点蛋白的互作网络图发现周期相关的Cdc、Cdk和Ccnd等蛋白,以及凋亡相关的Brca、Bcl和Bax等蛋白是互作网络中的关键靶点;通过检测细胞周期时相分布发现4T1细胞经过RSV处理后,S期细胞百分比增加,G1/G0期细胞百分比降低,细胞被阻滞在S期。以上结果表明RSV可能主要通过阻滞细胞周期诱导癌细胞凋亡。