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目的本课题以丹参酮ⅡA为目标药物,采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射法建立癫痫模型,对分别给予丙戊酸钠、丹参酮ⅡA(低、中、高剂量)的癫痫大鼠进行研究,通过对大鼠行为学、脑组织病理学、突触重塑相关蛋白SYN、PSD-95和BDNF-TrkB信号通路蛋白及基因表达的考察,探究丹参酮ⅡA改善癫痫大鼠痫性发作、认知功能的作用及调节突触可塑性的可能机制,为深入研究丹参酮ⅡA的药理作用及改善癫痫患者认知功能提出新思路和理论依据。方法1.将健康Wistar大鼠随机分为空白组(Blank)、模型组(Model)、丙戊酸钠组(VPA)、丹参酮ⅡA低剂量组(TSⅡA-L)、丹参酮ⅡA中剂量组(TSⅡA-M)和丹参酮ⅡA高剂量组(TSⅡA-H),采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射法建立癫痫模型(空白组注射等量生理盐水)。造模成功后每组20只大鼠,连续灌胃给药60天,空白组及模型组给予等量生理盐水。2.每组随机选取10只大鼠,以Racine分级标准为参考,记录各组大鼠癫痫发作情况。进行Morris水迷宫实验和八臂迷宫实验,记录水迷宫实验中大鼠的逃避潜伏期和在120 s内穿越原平台的次数,八臂迷宫实验中参考记忆.和工作记忆.错误次数,以及吃完食物臂中食物的总时间。3.迷宫实验结束后,各组大鼠经麻醉及灌注固定后,断头取脑,制备脑组织切片,以1%甲苯胺蓝染色,观察大鼠海马CA3区的组织病理变化;以Timm染液染色,观察海马苔藓纤维发芽情况;以醋酸铀和柠橡酸铅双重染色后,于透射电子显微镜下观察海马CA3区组织超微结构变化。4.造模并给药60天后,每组随机选取4只大鼠,麻醉及灌注固定后,断头取脑,制备冰冻切片,通过免疫荧光染色法考察突触重塑相关蛋白SYN、PSD-95和BDNF-TrkB信号转导通路蛋白的表达情况。5.造模并给药60天后,每组随机选取3只大鼠,麻醉后断头取脑,冰上剥离海马组织,通过实时荧光定量PCR检测SYN、PSD-95、BDNF和TrkB的基因表达情况。6.造模并给药60天后,每组随机选取3只大鼠,麻醉后断头取脑,冰上剥离海马组织,通过Western Blot实验考察SYN、PSD-95、BDNF和TrkB蛋白的表达情况。结果1.采用匹罗卡品成功建立癫痫模型后,与模型组相比,各给药组大鼠的发作级别和频次均呈现下降趋势。其中,VPA组、TSⅡA-M组和TSⅡA-H组的发作级别明显降低(P<0.01);VPA组、TSⅡA-L组、TSⅡA-M组和TSⅡA-H组的发作频率明显减少(P<0.05,P<0.01)。2.水迷宫实验中,与Model组相比,TSⅡA-L组、TSⅡA-M组和TSⅡA-H组定位航行时间显著降低(P<0.01),大鼠穿越平台次数显著增加(P<0.01)。与VPA组相比,TSⅡA-M组和TSⅡA-H组定位航行时间显著降低(P<0.01),大鼠穿越平台次数显著增加(P<0.01)。八臂迷宫实验中,与Model组相比,TSⅡA-L组、TSⅡA-M组和TSⅡA-H组的参考记忆、工作记忆错误次数显著降低(P<0.01)。与VPA组相比,TSⅡA-M组和TSⅡA-H组参考记忆、工作记忆错误次数显著降低(P<0.05,P<0.01)。TSⅡA-L组、TSⅡA-M组和TSⅡA-H组相比Model组的吃完食物总时间降低明显(P<0.05,P<0.01)。3.病理学实验结果表明,与Model组相比,给药丹参酮ⅡA后,神经元细胞形态逐渐趋于正常,TSⅡA-L组、TSⅡA-M组和TSⅡA-H组神经元细胞数目明显增加(P<0.05,P<0.01),海马CA3区苔藓纤维发芽明显减少(P<0.05,P<0.01),且脑组织超微结构排列紊乱、组织形态模糊及空泡变性的现象得到显著改善。VPA组神经元细胞形态及超微结构较模型组稍有好转,但神经元数目及苔藓纤维发芽情况未见明显改善(P>0.05)。4.免疫荧光染色结果显示,Model组大鼠SYN、PSD-95、BDNF、TrkB蛋白的表达相比Blank组均明显降低(P<0.05,P<0.01)。与Model组相比,VPA组SYN、PSD-95、BDNF、TrkB蛋白的表达略有增加,但无统计学差异(P>0.05);TSⅡA-L组SYN、PSD-95蛋白的表达均显著升高(P<0.01),BDNF、TrkB蛋白的表达亦明显增加(P<0.05)。TSⅡA-M组和TSⅡA-H组的SYN、PSD-95、BDNF、TrkB蛋白的表达均显著升高(P<0.01)。5.实时荧光定量PCR实验结果显示,Model组大鼠SYN mRNA、PSD-95mRNA、BDNF mRNA、TrkB mRNA的表达相比Blank组均明显降低(P<0.01)。与Model组相比,VPA组SYN mRNA、PSD-95 mRNA、BDNF mRNA、TrkB mRNA的表达略有增加,但不存在统计学差异(P>0.05);TSⅡA-L组SYN mRNA表达明显增加(P<0.05),PSD-95 mRNA、BDNF mRNA、TrkB mRNA表达亦显著升高(P<0.01)。TSⅡA-M组和TSⅡA-H组的SYN mRNA、PSD-95 mRNA、BDNF mRNA及TrkB mRNA表达均显著升高(P<0.01)。6.Western Blot实验结果表明,Model组大鼠SYN、PSD-95、BDNF、TrkB蛋白的表达相比Blank组均明显降低(P<0.01)。与Model组相比,VPA组SYN、PSD-95、BDNF和TrkB蛋白的表达略有增加,但不存在统计学差异(P>0.05);TSⅡA-L组SYN蛋白表达明显增加(P<0.05),PSD-95、BDNF、TrkB蛋白表达亦显著升高(P<0.01)。TSⅡA-M组和TSⅡA-H组的SYN、PSD-95、BDNF及TrkB表达均显著升高(P<0.01)。结论丹参酮ⅡA能够有效抑制癫痫的发作,并显著改善致痫大鼠学习记忆能力,缓解海马CA3区神经元及超微结构的损伤,抑制海马苔藓纤维发芽。丹参酮ⅡA能够增强突触重塑蛋白SYN、PSD-95及海马BDNF-TrkB通路的表达,调节突触可塑性,进而改善癫痫大鼠的认知功能。