樟属(Cinnamomum Schaeff.)系统发育与生物地理学研究——兼论ITS序列多态性和LEAFY基因复制

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全球约2/3有花植物集中分布于呈洲际间断分布的热带地区,其中热带美洲有着全球最高的物种丰富度,其次是热带亚洲。分布于热带美洲和热带亚洲的很多生物类群呈现出热带环太平洋间断分布格局,然而对该分布格局的成因探讨却十分匮乏。为了揭示热带环太平洋间断分布格局的形成原因,以起源古老、化石记录丰富而广泛、经历了众多地质历史事件和环境变迁,在新旧世界热带地区森林群落中扮演重要角色,其现今的物种分布式样代表了典型热带环太平洋间断分布格局的樟科樟属植物为例,借助三个核基因分子标记(ITS、LEAFY和RPB2)完成樟科樟属植物和其近缘物种的系统发育重建;利用生物地理事件和化石记录作为时间标定点,采用二次标定策略进行分化时间推算,并结合祖先分布区域重建分析,确定樟属植物的起源、分化时间和起源中心;结合化石记录以及古地质和古气候等多学科证据,揭示其起源与演化历程,探讨其热带环太平洋间断分布格局的成因,分析新旧世界热带森林群落的演化历史。主要研究结果和结论如下:  1.樟属和樟属群系统发育关系重建分析  采用三个核基因片段(ITS、LEAFY和RPB2)对94个樟属群和13个近缘外类群样本进行系统发育重建分析,结果显示樟属非单系群,但樟属群形成单系并得到强烈支持。樟属和樟属群植物分别聚在三个得到强烈支持的单系分支中,其中Clade1包括了几乎所有樟组样本,而Clade3涵盖了所有美洲樟属和被归入樟属群的单属种Mocinnodaphne cinnamomoidea以及三个Aiouea样本;其余样本,包括三个樟组样本、全部亚洲肉桂组物种、四个澳洲樟属物种以及非洲Ocoteaikonyokpe组成了Clade2。  在Clade2中,Ocotea ikonyokpe与其余样本互为姐妹群关系,建议将Ocoteaikonyokpe并入樟属;澳洲樟属物种形成单系聚在亚洲肉桂组中。在Clade3中,南美特有樟属物种和南美分布的Aiouea物种形成一单系分支,而北美特有樟属物种和美洲广布樟属物种,以及Mocinnodaphne cinnamomoidea形成另一单系分支,且这两单系支互为姐妹群关系。除了个别樟组物种聚在肉桂组中之外,本研究基本支持根据形态特征对樟属进行的属下阶元划分,即樟组、肉桂组和美洲樟属,分别对应于Clade1、Clade2和Clade3。单种属Mocinnodaphne聚在美洲樟属中,表明将可育雄蕊的轮数作为樟科科下属间的区分特征并不可靠。  2.樟属和樟属群生物地理学分析  生物地理学方面的研究表明北热带植物群的兴盛、衰退和瓦解在樟属和樟属群洲际间断分布格局的形成中发挥着主导作用。樟属和樟属群伴随着北热带植物群的兴盛起源于距今约55Ma始新世早期的劳亚古陆,此时樟属和樟属群植物可以借助白令海峡或者北大西洋陆桥在欧亚和北美大陆之间进行扩散传播;距今约50至48Ma,全球经历了第三纪第一次降温变冷过程,导致了樟属和樟属群植物形成目前欧亚—北美洲际间断分布格局的形成;距今约42至38Ma,全球经历了第三纪第二次降温变冷过程,此次降温导致樟属群植物形成目前亚洲樟属—非洲Ocotea ikonyokpe洲际间断分布格局。由于热带、亚热带成分的樟属和樟属群植物对降温非常敏感,因此会随着全球变冷而向低纬度迁移,并从高纬度消失。在向低纬度南移的过程中,从早始新世到晚中新世,发生了多次樟属和樟属群植物由北美进入南美的扩散事件;而在中新世早期,发生了一次樟属植物由亚洲进入澳洲的扩散事件,从而塑造了樟属目前的热带亚热带环太平洋间断分布格局和樟属群的泛热带间断分布格局。在樟属和樟属群植物南迁进入南美和澳洲的过程中,长距离扩散可能发挥着关键作用,其中取食樟属和樟属群植物肉质果实的鸟类可能扮演着重要角色,位于当时南美和北美、亚洲与澳洲之间的岛屿链在其中可能发挥重要的促进作用。  本研究支持樟属起源于始新世早期,并在中新世早期出现于澳洲,这与晚白垩纪,特别是与南半球晚白垩纪樟属化石记录存在巨大的时间差。综合前人和本文研究,我们认为仅仅依靠叶片和叶脉等特征相似性将很多化石归入樟属的做法并不可靠,尤其是晚白垩纪的樟属化石存在很大疑问,需要采用更可靠的证据进行重新考证。  3.樟属植物ITS序列的不完全一致性进化和假基因  对17个不能通过直接测序方式获得合格ITS序列的樟属样本采用克隆测序的方法,得到87条不同的ITS克隆序列。对这些克隆序列进行长度变异、GC含量、5.8S区二级结构稳定性、遗传距离、进化模式以及系统发育关系等相关分析,发现ITS序列在樟属植物内表现出明显的多态性,存在一致性进化不完全现象;87条序列中的22条被鉴定为假基因序列,其余65条序列为功能基因序列;假基因序列采用中性进化模式,变异明显大于功能序列。推测ITS序列在樟属植物中存在的一致性进化不完全和假基因现象也可能发生在樟科其它类群中,这可能是导致樟科植物ITS序列直接测序方式成功率低的重要原因。  4.LEAFY基因双拷贝和PCR介导重组  选取63个樟属物种,包括12个樟组物种,43个肉桂组物种和8个美洲樟属物种作为研究对象,探讨了LEAFY基因作为分子标记在樟属中的表现。通过克隆测序和数据分析,在其中38个肉桂组物种中得到了两种LEAFY基因拷贝,分别命名为“long sequence”拷贝和“short sequence”拷贝,而在樟组和美洲樟属中未发现类似情况。两种拷贝在碱基序列上高度相似,然而由于“shortsequence”拷贝相对于“long sequence”拷贝在第二个内含子区存在一个约47 bp的缺失,因此很容易将两者区分。“long sequence”拷贝在樟属系统发育分析中表现良好,然而在43个肉桂组物种中,5个物种未得到“short sequence”序列,9个物种中存在不同的“short sequence”克隆序列在系统树上不能聚为单系;同时,基于对ITS矩阵、LEAFY矩阵以及排除“long sequence”拷贝之后的LEAFY矩阵进行系统发育分析,发现在主要分支的系统关系上存在分歧,表明“shortsequence”拷贝用于樟属系统发育分析还存在很多问题。  研究发现LEAFY基因的两种拷贝高度相似,特别是在外显子区,采用在外显子区设计的扩增引物能够同时将两种拷贝扩增出来。对63个樟属物种开展PCR扩增实验和克隆测序,共计得到348条不同的LEAFY克隆序列,其中31条被RDP3和GARD分析鉴定为重组序列,分别发生在20个具有双LEAFY拷贝的肉桂组物种中。Shapiro-Wilk检验显示重组位点在重组序列上呈随机分布,未发现重组热点,分析认为这31条重组序列均来自于PCR介导重组。
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