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研究背景视网膜色素上皮(Retinal Pigment EPithelium, RPE)具有复杂的结构和特殊的生理机能。RPE能吞噬脱落的光感受器细胞外节膜盘(rodoutersegmeni, ROS),这对光感受器细胞外节的更新及维持正常视觉功能至关重要,其功能障碍会导致严重视网膜疾病和一些严重的遗传性变性眼病,如Best病、Stargardt病、Leber先天性黑曚和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD);等。因此应用RPE细胞移植治疗某些眼底疾病是其中的一个研究热点,目前面临的主要问题是如何获得合适的RPE移植细胞,才能在移植后与宿主残留的视网膜细胞达到最佳的整合效果,以求最大限度地重建患者的视功能。组织细胞工程尤其是干细胞工程的兴起为视网膜损伤的治疗提供了一种新的途径。极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cell, VSEL)是美国路易斯维尔大学Kucia研究小组从小鼠骨髓和人脐带血中分离出scal+lin-CD45-、具有类似胚胎干细胞生物特性的的多能干细胞,Liu等从小鼠视网膜神经上皮中分离了相似的视网膜多潜能干细胞(retinal multipotential stem-like cells, retinalPSC)。已有研究证实：这些多潜能干细胞不仅具有与胚胎干细胞相似的形态学特征和细胞标记物,而且具有胚胎干细胞多分化潜能的特性,在体外可以被诱导分化为内胚层、中胚层、外胚层细胞,潜在分化能力强,若作为组织工程和临床治疗的种子细胞,可避免伦理争议,具有良好的应用前景。通过免疫磁珠分选的方法,我们从新生小鼠小鼠的神经视网膜组织中得到scal+lin-CD45-的同一细胞亚群,通过细胞免疫荧光和流式细胞仪检测其特性,为视网膜移植的供体选择提供新的来源。当然,目前最广泛的种子细胞来源还是胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES).胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)具有无限扩增和多向分化潜能的特点,因此关于其诱导分化的研究成为干细胞研究的热点。如能在体外将胚胎干细胞(ESCs)源源不断地诱导分化成患者所需要的靶细胞(如RPE、光感受器细胞细胞),可望突破视网膜移植中面临的供体来源有限的难题,具有广阔的应用前景。目前,将ESCs体外诱导分化成RPE细胞的研究已经取得了一定的成果,借鉴皮肤黑色素细胞诱导时采用的ST2细胞层和类似的诱导条件,采用PA6间充质细胞系作为饲养细胞层,小鼠ES细胞能分化为呈六角形排列的、胞浆中出现色素颗粒的RPE细胞,但其诱导效率低。除了共培养或组织移植,目前尚无较好获得有效RPE的高效率方法。因此,我们设想建立一种无饲细胞层体外培养的小鼠ES诱导成光感受器和RPE的培养体系,提高ES向RPE诱导效率。目的1探讨免疫磁珠分选方法从新生C57小鼠视网膜神经上皮中分离出具有多潜能干细胞特性的scal+lin-CD45-细胞群的可行性。2研究小鼠视网膜多潜能干细胞与小鼠胚胎干细胞的形态特征及基因表达差异。3探讨小鼠视网膜多潜能干细胞向RPE分化的途径,建立一种无饲细胞层培养的小鼠ES分步诱导成RPE的高效培养体系。方法1小鼠视网膜多潜能干细胞的获取：取初生1天C57小鼠神经视网膜组织制成单细胞悬液,使用免疫磁珠分选的方法先行Lin-阴性分选后行Scal+阳性分选得到scal+lin-CD45-细胞群,使用流式细胞技术和细胞免疫荧光法鉴定其具有极小胚胎样干细胞的特性。2小鼠视网膜多潜能干细胞和胚胎干细胞的培养：用小鼠成纤维细胞作为饲细胞层,神经干细胞培养基和胚胎干细胞完全培养基分别培养两种细胞,并观察形态特性。3小鼠胚胎干细胞和视网膜多潜能干细胞及RPE的鉴定：采用碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase, AKP)进行小鼠ES鉴定,采用免疫组织化学方法检测小鼠视网膜多潜能干细胞；用Real Time-PCR方法检测全能性基因Oct4,Nagnog,Sox2在小鼠ES,小鼠视网膜多潜能干细胞与小鼠RPE的表达差异；Reverse Transcription-PCR检测小眼球相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase, Tyr)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein-1, TRP1),视网膜色素上皮细胞65蛋白(retinal pigment epithelial protein-65, RPE65)在小鼠ES,视网膜多潜能干细胞与RPE的表达差异。4小鼠ES与诱导产生的RPE基因表达差异性检测：小鼠ES无饲细胞层培养,并添加诱导因子进行26天的诱导方案,采用细胞免疫组织化学方法检测诱导形成的RPE,Real Time-PCR检测ES和RPE的Oct4、Nagnog、Sox2基因表达差异,Reverse Transcription-PCR检测MITF、TYR、TYRP1、RPE65在小鼠ES与RPE的表达差异。结果1小鼠视网膜多潜能干细胞分选率：利用免疫磁珠分选的方法从新生小鼠神经视网膜组织中分离出scal+lin-CD45-细胞群,细胞计数分选得率为1.2%。该细胞群干细胞抗原Scal表达率达96.5%,大小为2-6um,形态呈小圆形,核质比高。2小鼠视网膜多潜能干细胞组织形态学、免疫组化及基因表达：形态呈小圆形,直径2到6um, Scal表达阳性；全能性基因Oct4、Nagnog、Sox2的表达比小鼠ES低,比小鼠视网膜色素上皮细胞高,不表达RPE的标记性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65;小鼠ES呈克隆状生长,排列紧密,细胞集落隆突有立体感,边缘整齐清晰,形似鸟巢。单个细胞胞浆少,细胞核大,核仁明显,界限不清。AKP阳性,全能性基因Oct4、Nagnog、Sox2的高表达。3小鼠ES向RPE的定向诱导：本实验中尚未从小鼠视网膜多潜能干细胞成功获得RPE；但小鼠ES无饲细胞层培养并添加诱导因子可定向分化为RPE,获得的RPE角蛋白表达阳性,Oct4、Nagnog、Sox2不表达,表达RPE的标记性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65。结论1利用免疫磁珠分选的方法可以从新生C57小鼠神经视网膜中成功分离出scal+lin-CD45-细胞群,其分选率为1.2%。2小鼠视网膜scal+lin-CD45-细胞群具有VSEL的特性。形态呈小圆形,直径2到6um,全能性基因的表达比小鼠ES低,比小鼠视网膜色素细胞高,不表达RPE的标记性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65具有成体干细胞的特性。3本实验小鼠视网膜多潜能干细胞诱导成RPE存在一定困难,但成功建立了一种小鼠ES无饲细胞层培养并添加诱导因子向RPE诱导的高效培养方案。