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目的:成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)是一种以骨发育不良为主要特征的遗传病,最常见的病因是COL1A1或COL1A2基因突变所引起的Ⅰ型胶原合成不足或结构异常。目前临床上通过外科手术和双磷酸盐等药物进行治疗,无法改变胶原缺陷的根本。近年来,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗取得了显著成效,有望纠正胶原的缺陷,但同时也面临着MSCs移植率低和移植的MSCs难以生长分化等亟待解决的问题。本研究拟检测阿司匹林对脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)增殖、成骨分化和迁移等方面的影响,探讨阿司匹林影响ADSCs成骨分化和迁移的作用机制;并通过ADSCs和小剂量阿司匹林联合应用治疗成骨不全小鼠(osteogenesis imperfecta mice,oim),探讨此方法在OI治疗中的可行性、有效性和安全性。方法:(1)从野生型C57BL/6小鼠的脂肪组织中分离培养原代ADSCs,培养至第三代时,利用流式细胞仪对ADSCs表面的干细胞相关标记分子进行鉴定;对ADSCs进行成骨、成脂诱导培养,并采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、油红O染色对ADSCs的成骨、成脂分化潜能进行鉴定。(2)采用MTS法检测不同浓度(0、0.5、1、1.5、2、5、10mmol/L)阿司匹林对ADSCs增殖的影响;1.5 mmol/L阿司匹林处理ADSCs后用Annexin V标记凋亡细胞,利用流式细胞仪分析凋亡细胞所占比例,检测阿司匹林对ADSCs凋亡的影响。(3)将ADSCs分为对照组、单独成骨诱导组以及成骨诱导+阿司匹林组进行培养,通过ALP染色和ALP活性测定检测ADSCs的成骨分化情况;提取RNA后利用实时定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)比较三组细胞成骨相关基因(Col1a1、Runx2、Bglap、Osterix、β-catenin、Bmp2)转录水平的变化。(4)通过划痕实验和Transwell实验比较溶剂对照组(DMSO组)和1.5mmol/L阿司匹林组ADSCs的迁移能力;采用q-PCR方法比较细胞基质衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF1)和趋化因子受体CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)的转录水平,利用流式细胞仪分析两组中CXCR4阳性细胞所占比例,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测两组细胞培养上清中SDF1蛋白的含量。(5)分离培养红色荧光蛋白(red fluorecent protein,RFP)转基因小鼠的ADSCs(RFP-ADSCs),然后将oim小鼠分DMSO组、阿司匹林组、RFP-ADSCs组以及阿司匹林和RFP-ADSCs联合应用组进行治疗,野生型小鼠作为对照。3个月后,采用双能X射线吸收测定(dualenergy X-rayabsorptiometry,DXA)和Micro-CT对各组小鼠的股骨结构进行检测;将股骨组织制成石蜡切片,利用茜素红染色观察股骨矿化程度,利用免疫组化方法检测成骨相关因子的表达情况;通过ELISA方法检测各组小鼠血清中成骨相关因子的水平。结果:(1)经过流式细胞仪检测,培养至第三代的ADSCs高表达间充质干细胞相关标记分子CD29、CD44、CD90和Scal-1,低表达造血细胞相关标记分子CD45;成骨诱导后经ALP染色显示蓝紫色,成脂诱导后经油红O染色显示红色,证明成功分离培养出具有成骨、成脂分化潜能的ADSCs。(2)MTS实验结果显示,与对照组相比,经不同浓度阿司匹林处理的ADSCs增殖能力有不同程度的升高,且1.5 mmol/L浓度促进增殖作用最强,因此后续实验均选用此浓度;流式检测结果表明,经过1.5mmol/L阿司匹林处理的ADSCs的凋亡细胞比例明显低于对照组。(3)ALP染色及ALP活性检测结果表明,成骨诱导+阿司匹林组的ALP活性最强;q-PCR结果显示,单独成骨诱导组的Col1a1等成骨相关基因表达量显著升高,而成骨诱导+阿司匹林组显著高于单独成骨诱导组,且β-catenin和Bmp2的基因表达量最高,表明Wnt/β-catenin及BMP2途径可能是阿司匹林促进ADSCs成骨分化的通路。(4)划痕实验结果显示阿司匹林处理组的细胞迁移距离显著大于对照组,Transwell检测结果显示阿司匹林组迁移到小室背面的ADSCs数目明显多于对照组,两种实验结果都证明阿司匹林可使ADSCs的迁移能力有很大程度的提高;q-PCR结果显示,阿司匹林处理3天后Cxcr4和Sdf1的基因表达量显著高于对照组,流式结果显示阿司匹林组中CXCR4~+细胞明显增多,ELISA结果表明阿司匹林组细胞培养上清中的SDF1含量显著高于对照组,表明SDF1-CXCR4途径是阿司匹林促进ADSCs迁移的通路之一。(5)分组对oim小鼠治疗3个月后,DXA和Micro-CT的检测结果显示阿司匹林与ADSCs联合治疗组小鼠的全身骨密度以及股骨的骨小梁数目等指标均有所升高;茜素红染色结果显示联合治疗组股骨的皮质骨矿化情况明显改善;免疫组化染色显示联合组治疗组的RFP标记显著多于ADSCs组,且联合组的股骨中成骨因子BGLAP和成血管因子CD31表达最多;ELISA检测表明联合治疗组血清中的成骨因子PⅠNP和细胞迁移因子SDF1水平最高,而破骨因子CTXⅠ和炎症因子COX2水平最低。结论:低、中浓度(0.5~2 mmol/L)的阿司匹林可促进ADSCs增殖,高浓度(5~10mmol/L)时则抑制增殖。1.5mmol/L的阿司匹林可抑制ADSCs凋亡,并且可能通过Wnt/β-catenin及BMP2途径促进ADSCs的成骨分化,通过SDF1-CXCR4途径促进ADSCs迁移。阿司匹林和ADSCs的联合应用可显著提高oim小鼠的骨密度和骨量,改善股骨微观结构,促进骨形成和血管生成,表现出良好的治疗效果,为OI的临床治疗提供了新的思路和方法。