细菌形成生物膜在细菌持续性感染中起着重要的作用,生物膜内的细菌比浮游的细菌对抗生素的耐药性可高出几个数量级。据报道,临床上超过80%的恶性感染均与细菌生物膜耐药有关。3’,5’-环二鸟苷（c-di-GMP）是一种广泛存在于细菌中的第二信使,参与调控包括细菌生物膜形成及毒力因子释放在内的多种生物学功能。研究显示,高水平的c-di-GMP会诱使细菌选择群聚生存方式,显著促进生物膜形成。因此靶向c-di-GMP通路有望实现细菌生物膜的有效抑制。最新研究发现,在生理条件下,c-di-GMP分子能自发的形成一种G-四链体高级结构,并且一旦形成这种结构,c-di-GMP则不能与其靶蛋白结合从而丧失其生物学功能。同时,已有报道某些芳香族化合物可以诱导并稳定c-di-GMP G-四链体结构。因此,利用小分子直接作用于c-di-GMP本身,通过诱导其形成功能缺失型G-四链体,间接降低其有效浓度,是一个极具潜力的抗生物膜药物设计新方向。因此本论文提出了基于细菌重要信号分子c-di-GMP高级结构（G-四链体）这一全新抗生物膜药物设计策略,并系统研究了此策略的可行性,以期发现基于此策略的新型抗生物膜苗头化合物,为克服细菌生物膜耐药提供新的选择。主要内容包括:1、以已报道的c-di-GMP G-四链体诱导剂噻唑橙（thiazole orange,TO）为模型分子,探究以c-di-GMP高级结构（G-四链体）调控为靶点的新型抗细菌生物膜药物设计策略的可行性。利用多种生物学方法和手段,系统的评价了诱导剂TO对铜绿假单胞菌生物膜形成能力的抑制作用,结果显示,诱导剂TO在2.5μg/m L浓度时,对铜绿假单胞菌的生物膜抑制率可达具有50%左右。进一步通过报告菌株PAO1-Δwsp F-mini-ctx-pel A-lac Z及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）证明了诱导剂TO对受c-di-GMP调控的Pel、Psl操纵子及其下游多个相关基因的表达具有显著影响,以上结果验证了诱导剂TO的作用靶点为c-di-GMP信号分子通路。同时,通过c-di-GMP生物传感器,观察到了细菌内c-di-GMP-TO复合物的荧光,证明了化合物TO在细菌体内与c-di-GMP的相互作用,并通过检测诱导剂TO对c-di-GMP代谢酶活性的影响,证明了化合物不是通过影响相关代谢酶的活性而是通过直接与cdi-GMP作用,从而实现对c-di-GMP通路生物学功能的影响。综合以上结果,初步证明了本论文提出的新策略的可行性。2、为了克服诱导剂TO的DNA嵌入毒性,发现低毒有效且具有临床应用前景的诱导剂,对本课题组前期设计合成的新型c-di-GMP G-四链体诱导剂进行了活性筛选及构效关系研究。首先通过圆二光色谱（CD）实验,对化合物的诱导活性进行测试,筛选出了2a、2e、2f以及5h等诱导活性优于阳性药物TO的化合物。同时,对所有的化合物的抗铜绿假单胞菌生物膜形成作用进行了初筛,发现诱导剂5h在1.25μM时对铜绿假单胞菌生物膜抑制率可达60%以上。此外,利用荧光分光光度法测试了化合物与c-di-GMP以及其他核酸类似物相互作用时的荧光变化,证明了化合物能够选择性的作用于c-di-GMP,并通过连续滴定法,计算出了化合物5h与c-di-GMP相互作用时的化学计量比为1:4.5。最后,通过对所有诱导剂的诱导活性、选择特异性以及对铜绿假单胞菌生物膜抑制能力筛选结果的系统分析,总结得到了相关化合物的构效关系,为今后合理设计新型c-di-GMP G-四链体诱导剂提供了一定的理论依据。最后,发现了基于此策略的新型抗细菌生物膜苗头化合物5h。3、C-di-GMP G-四链体诱导剂5h的作用机制研究及生物安全性评价。通过测试化合物5h对细菌swarming运动、胞外多糖分泌等的影响,证实了5h能够有效调控受c-di-GMP分子调节的相关表型。通过测试化合物5h对报告菌株PAO1-Δwsp F-mini-ctx-pel A-lac Zβ-半乳糖苷酶产生的影响,及通过转录组数据分析,从基因表达水平证明了化合物5h对细菌体内受c-di-GMP调节的相关基因表达的影响。另外,通过测试化合物5h对c-di-GMP相关代谢酶活性的影响,证明了化合物5h对细菌体内c-di-GMP相对含量的影响不是通过改变其代谢酶的活性。以上结果揭示了诱导剂5h的作用机制为诱导c-di-GMP信号分子形成生物学功能丧失的G-四链体结构,与本论文提出的新策略一致。最后,利用MTT实验和凝胶电泳实验证明了化合物5h不存在已报导的诱导剂TO的DNA嵌入毒性,并且其生物安全性在一定的浓度范围内可以得到保证,因此,化合物5h有望成为治疗铜绿假单胞菌生物膜慢性感染的潜在先导化合物。