研究背景树突状细胞作为一种专职的抗原提呈细胞,其能够对抗原成分进行吞噬、加工和处理并将处理后的抗原呈递于细胞表面,从而对免疫系统内的其它细胞进行抗原提呈。由于树突状细胞所具有的这种特殊作用,由其制备而成的治疗性肿瘤疫苗已经被逐渐应用于人类肿瘤性疾病的治疗。然而,研究发现处于肿瘤环境中的未成熟树突状细胞并不具有有效的抗原提呈功能。为了克服这一限制,较为常用的方法是通过体外培养骨髓细胞从而获得未成熟的树突状细胞,随后使用肿瘤特异性抗原物质对未成熟的树突状细胞进行激活,使这些细胞能够在促炎性刺激物的诱导下逐渐成熟。目前,针对人类肿瘤性疾病的实验性免疫治疗当中有许多都是基于树突状细胞的肿瘤疫苗免疫疗法,而这些实验性治疗中所使用的树突状细胞均为来自于患者自身的自体树突状细胞。对于以树突状细胞为基础的肿瘤疫苗免疫治疗实验而言,其作用机制与临床治疗具有强烈的相关性,并且这些治疗方法有望在将来被逐渐应用于临床,从而为肿瘤患者的系统性治疗带来新的方法。然而,到目前为止,相关的临床试验结果并来显示出良好的整体治疗效果,树突状细胞肿瘤疫苗的疗效仅仅局限于少数患者。由于进入机体内的树突状细胞肿瘤疫苗需要到达次级淋巴器官或淋巴组织内才能有效地激活机体的抗肿瘤免疫反应,所以疫苗是否能够成功迁移至机体的次级淋巴器官或淋巴组织将极大的影响免疫治疗的有效性。树突状细胞肿瘤疫苗的注射路径和注射频率以及注射的细胞数量均与有活力的树突状细胞在机体内的迁移效率存在强烈的相关性,并且这些因素也能够对随后的治疗结果产生决定性的影响。目前,对于树突状细胞肿瘤疫苗的制备和应用尚未有统一的标准被建立。尽管相关的研究已经表明体外条件下制备肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞肿瘤疫苗是一种可行且有效的方法,但是对于肿瘤疫苗的最佳注射路径这一问题却仍然存在着较大的争议。考虑到机体的腹腔内存在有大量的引流淋巴结以及脾脏这个最大的淋巴器官,从理论上而言,腹腔注射树突状细胞肿瘤疫苗应当是一种可行且有效的治疗方式。然而迄今为止尚很少有腹腔注射树突状细胞肿瘤疫苗的相关报道来支持这一观点,因此这种治疗方式的有效性以及治疗效率仍需进一步的动物实验来证实。鉴于以上研究现状,本实验准备在以往的树突状细胞体外培养技术的基础上探索一种更为有效的树突状细胞获取以及体外培养的方法,并通过小鼠体内试验来研究腹腔注射方式是否能够促进树突状细胞向引流淋巴结、淋巴组织和淋巴器官的迁移。此外,本实验拟通过骨肉瘤小鼠模型的体内试验来研究腹腔注射树突状细胞肿瘤疫苗在骨肉瘤治疗方面的有效性,从而为骨肉瘤的临床治疗提供一种新的思路。第一部分树突状细胞腹腔淋巴结内迁移-骨肉瘤免疫治疗的机制研究目的:在以往研究的基础上探索更有效的树突状细胞获取以及体外培养的方法并通过使用健康的小鼠作为动物模型来研究经腹腔注射途径给予树突状细胞的方法是否能够促进树突状细胞在小鼠体内的吸收以及迁移。方法:通过冲洗C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓腔的方法获取骨髓细胞,使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液进行细胞培养并向培养液中加入终浓度为10ng/ml的 rm-GM-CSF、1ng/ml的 rm-IL-4、100 单位/ml 的青霉素、100μg/ml的链霉素以及0.25 μg/ml的两性霉素B,从而促使骨髓细胞中的树突状细胞前体细胞向未成熟的树突状细胞分化。在细胞培养的第7天时,向细胞培养液中加入终浓度为100 ng/ml的IFN-γ、250ng/ml的LPS以及20 ng/ml的TNF-α,使未成熟的树突状细胞向成熟的树突状细胞转化,继续培养1天后即可获得成熟的骨髓来源树突状细胞。随后使用流式细胞术检测体外培养8天后的骨髓细胞中 CD11c、CD11b、CD40、CD86、CD80、H-2Db、H-2Kb 以及MHC Ⅱ分子的表达情况,从而明确树突状细胞的纯度和成熟度。通过向小鼠腹腔内注射墨汁,观察小鼠腹腔内淋巴结和淋巴组织的分布以及墨汁染色情况;向小鼠腹腔内注射PKH26红色荧光染料标记的成熟树突状细胞,随后获取小鼠脾脏、胰腺以及肠道和周围组织,采用石蜡切片、冰冻切片、H&E染色、DAPI染色、光学显微镜观察以及荧光显微镜观察等方法,检测相应组织中树突状细胞的含量。结果:1.每只小鼠的骨髓组织中可以获得的细胞总数为1.0-1.2 x 107个;经过8天的体外细胞培养后,可以获得的成熟树突状细胞总数为1-2x108个。与以往的实验相比,本实验获取的骨髓细胞数量和成熟树突状细胞数量均明显增多。此外,在细胞培养的第1天至第7天的过程中,光镜下能够观察到具有典型树突状细胞特点的骨髓来源细胞的动态发育过程。2.流式细胞术检测发现培养8天后的骨髓来源细胞能够大量地表达CD11c、CD11b、CD40、CD86、CD80、H-2Db、H-2Kb 以及 MHC Ⅱ这些能够代表树突状细胞成熟的标志物,表明本实验所获得的小鼠骨髓来源细胞中的树突状细胞纯度相对较高,并且成熟的树突状细胞在所有细胞中所占的比例也较大。3.腹腔注射墨汁30分钟以后,小鼠腹腔内的淋巴结和淋巴管能够在肉眼下被直接辨认。H&E染色切片显示,腹腔内的淋巴器官能够显著的吸收墨汁。4.荧光显微镜观察发现小鼠的脾脏、胰腺和肠道的冰冻组织切片内均有红色荧光标记的成熟树突状细胞存在。ImageJ软件量化脾脏内树突状细胞数量百分比,结果显示腹腔注射以后在不同时间点上测得的树突状细胞数量百分比之间无显著性差异。结论:通过本实验所使用的树突状细胞体外培养方法能够获得大量成熟的小鼠骨髓来源树突状细胞。此外,腹腔注射的成熟树突状细胞在小鼠腹腔内表现出良好的吸收和迁移效率。第二部分树突状细胞肿瘤疫苗免疫治疗小鼠骨肉瘤的体内试验研究目的:研究腹腔注射途径给予树突状细胞肿瘤疫苗是否能够在骨肉瘤小鼠模型体内引起有效的肿瘤特异性细胞毒性T细胞反应以及该方法是否能够成为一种治疗小鼠骨肉瘤的有效手段。方法:制作C3H小鼠骨肉瘤模型,采用背部皮下注射2x106个LM8骨肉瘤细胞的方法并将小鼠随机分为对照组和实验组。树突状细胞肿瘤疫苗的制备以及腹腔注射树突状细胞肿瘤疫苗的方法如下:通过中波紫外线照射法制备LM8骨肉瘤细胞裂解产物,将肿瘤细胞裂解产物与体外培养的C3H小鼠骨髓细胞共同培养从而获得肿瘤抗原致敏的树突状细胞肿瘤疫苗。在实验的第14天、21天和28天分别向治疗组小鼠腹腔内注射一次树突状细胞肿瘤疫苗(1.5ml含有5 x 106个细胞的PBS液),同时向对照组小鼠腹腔内注射等量的生理盐水。每组小鼠按照观察时间随机分为7天、21天和35天三个亚组。在实验的第7天、21天和35天分别处死相应亚组的小鼠,并且记录每只被处死小鼠体内肿瘤的体积以验证肿瘤疫苗治疗骨肉瘤的效果。此外,分别获取健康小鼠、使用未致敏的树突状细胞进行治疗的荷瘤小鼠和使用致敏的树突状细胞进行治疗的荷瘤小鼠的脾脏,使用CD8a阳性T细胞分离试剂盒和LS柱对脾脏内的CD8a阳性T细胞进行分离纯化。随后使用标准的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒对纯化后的三组CD8阳性T细胞进行细胞毒性检测。最后,制备对照组与治疗组小鼠骨肉瘤的组织切片并进行TUNEL染色,随后对染色图像进行精确的量化分析以检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果:1.通过计算各亚组小鼠肿瘤体积的平均数与标准差并绘制肿瘤的生长曲线发现,与对照组相比,树突状细胞肿瘤疫苗治疗组的肿瘤生长受到了明显的抑制(P<0.0001)。2.体外细胞毒性试验发现,肿瘤抗原致敏的树突状细胞肿瘤疫苗治疗组的T细胞所产生的细胞毒性明显强于原始T细胞所产生的细胞毒性。肿瘤抗原致敏的树突状细胞肿瘤疫苗治疗组的T细胞所产生的细胞毒性明显强于未致敏的树突状细胞治疗组的T细胞所产生的细胞毒性。随着T细胞与肿瘤细胞的比例逐渐增大,CD8阳性T细胞所产生的细胞毒活性也逐渐增大。体外细胞毒性试验的结果与体内试验的治疗效果是一致的。3.TUNEL染色结果显示,树突状细胞肿瘤疫苗能够在治疗组小鼠体内诱导细胞凋亡的出现。根据HistoQuest软件分析的结果显示,在实验的第7天时,两组小鼠的凋亡指数基本处于同一水平,两组结果之间的差异无统计学意义(P=0.7650);在实验的第21天时,实验组小鼠的凋亡指数明显高于对照组小鼠的凋亡指数,两组结果之间的差异具有统计学意义(P<0.0001);在实验的第35天时,实验组小鼠的凋亡指数也明显高于对照组小鼠的凋亡指数,两组结果之间的差异具有统计学意义(P<0.0001)。结论:通过腹腔注射途径给予大剂量的治疗性树突状细胞肿瘤疫苗进行抗肿瘤免疫治疗能够在小鼠体内引起有效的肿瘤特异性细胞毒性T细胞反应并有效的抑制小鼠体内骨肉瘤的生长。由于这种治疗方法具有被直接转换到临床骨肉瘤治疗当中的可能,因此该方法在未来有望成为继手术治疗与新辅助化疗之后治疗人类骨肉瘤的又一有效手段。