【摘 要】
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目的:利用高通量单细胞转录组测序技术研究顺铂化疗前后小儿肝母细胞瘤（Hepatoblastoma,HB）患儿外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）中细胞异质性,探索顺铂化疗前后小儿肝母细胞瘤患儿的PBMC的细胞组成并绘制细胞图谱,然后使用生物信息分析手段来了解差异表达基因,初步探究顺铂化疗前后小儿肝母细胞瘤患儿PBMC中影响患儿治疗相关的
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目的:利用高通量单细胞转录组测序技术研究顺铂化疗前后小儿肝母细胞瘤（Hepatoblastoma,HB）患儿外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）中细胞异质性,探索顺铂化疗前后小儿肝母细胞瘤患儿的PBMC的细胞组成并绘制细胞图谱,然后使用生物信息分析手段来了解差异表达基因,初步探究顺铂化疗前后小儿肝母细胞瘤患儿PBMC中影响患儿治疗相关的细胞亚群以及关键基因。方法:取得一个患儿化疗前后的2个外周血样本,分别取自于患者第一次化疗前2天以及患者第一次化疗疗程结束后4天。对取得的每个样本进行处理,形成2个PBMC样本,建库后Agilent 2100 bioanalyzer instrument确定文库片段大小,q PCR定量分析,建立好的两个文库用BGISEQ-500测序仪进行测序。而后使用Cell Ranger v2.0软件处理原始FASTQ文件,使用STAR将测序读数与GRCh38标准参考转录组进行校准比对,并为每个细胞生成过滤后的UMI表达谱,将最大基因数＞90%或＜200以及线粒体基因含量＞7.5%的细胞丢弃,质控筛选后数据使用Seurat v2.0.1软件包处理,采用UMAP算法对两个样本进行聚类识别,使用生物信息学的技术方法对2个样本的单细胞测序结果进行分析,比较化疗前后两个PBMC样本的细胞构成的差异,绘制出小儿肝母细胞瘤化疗前后的PBMC细胞图谱,对其中变化明显以及免疫相关的部分进行对比分析。结果:两个PBMC样本测序后,对测序数据使用生物信息学的技术方法进行分析,化疗前PBMC样本聚类形成了14个Cluster,其中对比Cell Marker数据库后鉴定出13种细胞类型;而化疗后PBMC样本聚类形成了11个Cluster,其中对比Cell Marker数据库后鉴定出11种细胞类型。在单细胞分析中,我们观察到顺铂化疗后外周血单个核细胞中的细胞团组成发生了变化。化疗后辅助T细胞、自然杀伤性T细胞、调节性T细胞是前三位的细胞群,浆细胞、CD8+效应性记忆T细胞、B细胞以及浆细胞样树突样细胞这四个Cluster中的细胞明显减少。我们的研究全面了解了化疗期间免疫细胞的变化,其中总T细胞比例增加约6%,主要发生在调节性T细胞和辅助T细胞,即CD4+细胞,同时化疗后CD8+效应性记忆T细胞也减少了大约50%。化疗前后PBMC标记性基因的差异表达基因,发现GNLY和KLRC1在肝母细胞瘤患儿顺铂化疗前后变化最为显著;而在T细胞亚群中,PASK基因在自然杀伤性T细胞、辅助T细胞和调节性T细胞中表达上调,COTL1基因在CD8+效应性T细胞、辅助T细胞和调节性T细胞中表达上调。经过GO、KEGG富集后,其结果发现细胞活化、淋巴细胞活化和免疫系统过程调节相关基因在4种T细胞中均有富集,均为免疫激活过程中的关键部分。富集分析中我们发现在本实验中Th17cell分化通路在KEGG富集结果为其中最显著的;而抗体处理与提呈富集程度最高,而对应的差异表达基因的Pathway均为有机系统。结论:发现HB患儿PBMC的细胞异质性,同时验证HB也存在免疫抑制,并且发现肝母细胞瘤患者的PBMC中潘氏细胞呈现高丰富程度,考虑其可能影响细胞免疫。实验结果验证了顺铂化疗后存在免疫激活。
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