神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)的低温冷冻保存对于神经退行性疾病和神经组织损伤的研究与治疗具有十分重要的意义。为改善神经干细胞的冷冻保存效果,本课题采用近年来迅速发展起来的无冰晶保存技术——玻璃化法对神经干细胞进行冷冻保存。本文首先根据低温保护剂(CPA)导入过程的细胞体积变化情况设计了等渗透压差、时间间隔逐渐降低的六步导入方法,并对神经干细胞单细胞悬液的玻璃化进行优化,且对冻后复苏的细胞进行培养观察和干细胞特性鉴定。然后分别采用两种不同的神经球尺度筛选方法——培养时间分布法和细胞筛网法获得不同直径范围的神经球,用渗透压仪测定保护剂一次性导入不同尺度的神经球后的渗透压变化曲线,根据渗透平衡时间,设计不同的导入方法,并进行玻璃化冻存,用CCK-8法比较玻璃化组、慢冻组及导入组冻后细胞的相对活性。分别采用Hoechst/PI双染法鉴定冻后细胞球的完整性,采用nestin特异性蛋白鉴定冻后NSCs的干细胞特性,并将冻后细胞诱导分化,进行神经干细胞多向分化能力的免疫荧光鉴定。实验结果显示,采用每步导入CPA的体积为50μl、64μl、86μl、120μl、180μl、300μl,每步导入后对应的平衡时间分别为85s、75s、65s、55s、45s、35s的导入方案对NSCs进行玻璃化冻存,冻后细胞活率达到了85.5%,且仍具有良好的生长状态和较强的增殖能力,经Nestin特异性蛋白鉴定,冻后细胞仍具有神经干细胞特性,这说明采用等渗透压差、平衡时间间隔逐渐减小的分步导入方法可以有效地减轻细胞的渗透性损伤和毒性损伤。实验结果还表明,CPA一次性导入各尺度范围的神经球所需的渗透平衡时间是随细胞球的尺度和单位体积细胞数的增大而增大的。在本实验所选取的直径范围(＜100μm)内,对比玻璃化法和常规慢速冻存法,发现经过两种方法冻后细胞的相对活性都随着神经细胞球尺度的增加而增加,但是采用玻璃化法冷冻保存的神经球,其冻后细胞活性以及其在维持球状形态和结构的完整性方面都要显著好于常规慢速冻存法。且玻璃化法冷冻保存后的神经干细胞球仍具有神经干细胞的特性及其多向分化能力。