论文部分内容阅读
目的：无机硝酸盐补充可以增加机体内一氧化氮（nitricoxide，NO）的生物利用度，有提高运动能力的潜在作用。本研究通过分析硝酸盐补充和一次性运动对大鼠骨骼肌钙稳态的影响及机制，探究硝酸盐补充提高运动能力的内质网机制。
方法：离体实验采用大鼠骨骼肌L6细胞，通过毒胡萝卜素诱导内质网应激，以亚硝酸钠（sodiumnitrite，NaNO2）作为NO供体、L-单甲基精氨酸（NG-Monomethyl-L-arginine，L-NMMA）作为一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）抑制剂进行干预。比色法检测各组细胞NO浓度和内质网钙离子浓度；蛋白质印记法检测骨骼肌内质网葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulatedprotein78，GRP78）、蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase，PDI）、钙网织蛋白（calreticulin，CRT）、兰尼碱受体1(ryanodinereceptor1，RyR1)、肌集钙蛋白1（calsequestrin-1，CASQ1）、肌浆网/内质网钙-三磷酸腺苷酶（sarcoplasmic/endoplasmicreticulumcalciumATPase1/2，SERCA1/2）蛋白及其S-亚硝基化蛋白表达水平。在体实验采用128只8周龄SD大鼠，随机分为安静对照组（C）、安静低剂量组（LN）、安静中剂量组（MN）、安静高剂量组（HN）、一次性力竭对照组（EC）、一次性力竭低剂量组（ELN）、一次性力竭中剂量组（EMN）和一次性力竭高剂量组（EHN），每组16只。各低、中、高剂量组分别按照0.3、0.7、1mmol/kgBW/d剂量灌胃4周硝酸钠（sodiumnitrate，NaNO3）。每周日取尾血测NO浓度。4周后各力竭组进行速度16m/min，坡度-16°的一次性力竭跑台运动，记录运动时间。运动后即刻和24小时分别取脑、心脏、肝脏、脾脏和肾脏，称重，计算脏器系数；取腓肠肌、比目鱼肌和趾长伸肌进行指标测试。观察骨骼肌组织形态和超微结构变化；比色法检测血清和骨骼肌NO浓度、骨骼肌NOS活性和内质网钙离子浓度；蛋白质印记法检测骨骼肌内质网GRP78、PDI、CRT、RyR1、CASQ1、SERCA1/2蛋白表达。
结果：（1）NaNO2干预通过S-亚硝基化修饰影响GRP78、PDI、RyR1、SERCA1和SERCA2功能，对钙离子通道蛋白功能和伴侣蛋白表达水平的调节是硝酸盐维持钙稳态的主要途径；（2）NaNO2干预可部分代偿L-NMMA诱导的NO可用性降低；（3）4周硝酸盐补充可以延长一次性离心跑台运动时间，0.7和1mmol/kgBW/d剂量组作用显著；（4）4周硝酸盐补充可以缓解一次性离心跑台运动后24小时内大鼠腓肠肌、比目鱼肌和趾长伸肌的损伤程度；（5）4周硝酸盐补充可以提高大鼠NO可用性水平，效果随补充剂量升高而升高，不同肌纤维类型之间无效果差异，不受NOS活性影响；（6）4周硝酸盐补充可以缓解一次性离心跑台运动后骨骼肌内质网应激，0.7和1mmol/kgBW/d剂量组作用显著，不同肌纤维类型之间无效果差异；（7）4周硝酸盐补充可以提高大鼠内质网钙离子浓度，1mmol/kgBW/d剂量组作用显著，其原因可能与NO上调CASQ1、SERCA1/2蛋白表达水平，增加内质网钙储量有关，不同肌纤维类型之间无效果差异。
结论：（1）无机硝酸盐补充可以提高NO生物可用性，代偿内源性NO不足引起的功能障碍；（2）4周硝酸盐补充对一次性离心力竭运动引起的骨骼肌钙稳态失衡和内质网应激具有缓解作用，其有效性与剂量有关；（3）硝酸盐补充改善运动能力的内质网机制可能是：随着NO生物可用性的增加，CASQ1和SERCA表达水平提高，静息时内质网钙储量增加；通过S-亚硝基化修饰改善RyR1和SERCA活性，加快运动时钙离子跨膜交换速度；而高表达的CASQ1可起到缓冲作用。硝酸盐通过维持内质网钙稳态，降低内质网应激水平，减轻肌纤维损伤，最终使运动能力得到改善。
方法：离体实验采用大鼠骨骼肌L6细胞，通过毒胡萝卜素诱导内质网应激，以亚硝酸钠（sodiumnitrite，NaNO2）作为NO供体、L-单甲基精氨酸（NG-Monomethyl-L-arginine，L-NMMA）作为一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）抑制剂进行干预。比色法检测各组细胞NO浓度和内质网钙离子浓度；蛋白质印记法检测骨骼肌内质网葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulatedprotein78，GRP78）、蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase，PDI）、钙网织蛋白（calreticulin，CRT）、兰尼碱受体1(ryanodinereceptor1，RyR1)、肌集钙蛋白1（calsequestrin-1，CASQ1）、肌浆网/内质网钙-三磷酸腺苷酶（sarcoplasmic/endoplasmicreticulumcalciumATPase1/2，SERCA1/2）蛋白及其S-亚硝基化蛋白表达水平。在体实验采用128只8周龄SD大鼠，随机分为安静对照组（C）、安静低剂量组（LN）、安静中剂量组（MN）、安静高剂量组（HN）、一次性力竭对照组（EC）、一次性力竭低剂量组（ELN）、一次性力竭中剂量组（EMN）和一次性力竭高剂量组（EHN），每组16只。各低、中、高剂量组分别按照0.3、0.7、1mmol/kgBW/d剂量灌胃4周硝酸钠（sodiumnitrate，NaNO3）。每周日取尾血测NO浓度。4周后各力竭组进行速度16m/min，坡度-16°的一次性力竭跑台运动，记录运动时间。运动后即刻和24小时分别取脑、心脏、肝脏、脾脏和肾脏，称重，计算脏器系数；取腓肠肌、比目鱼肌和趾长伸肌进行指标测试。观察骨骼肌组织形态和超微结构变化；比色法检测血清和骨骼肌NO浓度、骨骼肌NOS活性和内质网钙离子浓度；蛋白质印记法检测骨骼肌内质网GRP78、PDI、CRT、RyR1、CASQ1、SERCA1/2蛋白表达。
结果：（1）NaNO2干预通过S-亚硝基化修饰影响GRP78、PDI、RyR1、SERCA1和SERCA2功能，对钙离子通道蛋白功能和伴侣蛋白表达水平的调节是硝酸盐维持钙稳态的主要途径；（2）NaNO2干预可部分代偿L-NMMA诱导的NO可用性降低；（3）4周硝酸盐补充可以延长一次性离心跑台运动时间，0.7和1mmol/kgBW/d剂量组作用显著；（4）4周硝酸盐补充可以缓解一次性离心跑台运动后24小时内大鼠腓肠肌、比目鱼肌和趾长伸肌的损伤程度；（5）4周硝酸盐补充可以提高大鼠NO可用性水平，效果随补充剂量升高而升高，不同肌纤维类型之间无效果差异，不受NOS活性影响；（6）4周硝酸盐补充可以缓解一次性离心跑台运动后骨骼肌内质网应激，0.7和1mmol/kgBW/d剂量组作用显著，不同肌纤维类型之间无效果差异；（7）4周硝酸盐补充可以提高大鼠内质网钙离子浓度，1mmol/kgBW/d剂量组作用显著，其原因可能与NO上调CASQ1、SERCA1/2蛋白表达水平，增加内质网钙储量有关，不同肌纤维类型之间无效果差异。
结论：（1）无机硝酸盐补充可以提高NO生物可用性，代偿内源性NO不足引起的功能障碍；（2）4周硝酸盐补充对一次性离心力竭运动引起的骨骼肌钙稳态失衡和内质网应激具有缓解作用，其有效性与剂量有关；（3）硝酸盐补充改善运动能力的内质网机制可能是：随着NO生物可用性的增加，CASQ1和SERCA表达水平提高，静息时内质网钙储量增加；通过S-亚硝基化修饰改善RyR1和SERCA活性，加快运动时钙离子跨膜交换速度；而高表达的CASQ1可起到缓冲作用。硝酸盐通过维持内质网钙稳态，降低内质网应激水平，减轻肌纤维损伤，最终使运动能力得到改善。