研究背景:前列腺癌在欧美男性恶性肿瘤发病中居于榜首,是男性恶性肿瘤死亡率第二位的肿瘤。我国前列腺癌的发病率虽然较西方国家低,但近年来发病率呈快速上升趋势,严重危害老年男性的健康。因此如何预防和治疗前列腺癌一直是泌尿外科肿瘤研究的重点与热点。放疗(内放射和外放射)是前列腺癌治疗的重要方法之一,尤其是分期在T3期以上的雄激素非依赖性前列腺癌。虽然放疗起初疗效较好,但前列腺癌细胞最终会出现放疗耐受,导致肿瘤进展。放疗杀伤肿瘤细胞的主要机理是损伤肿瘤细胞DNA。DNA的损伤则主要与细胞周期停止、细胞老化和介导细胞凋亡等因素密切相关。而前列腺癌细胞耐受放疗的主要是癌细胞可经同源性重组(Homologous recombination,HR)和非同源性末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)等途径对受损的DNA进行修复。对临床标本的分析显示:前列腺癌细胞中DNA修复相关蛋白的表达程度和其化疗敏感度相关。抑制肿瘤细胞DNA的修复,可以显著增加放疗的疗效。因此,DNA损伤是放疗杀伤肿瘤细胞的主要因素。通过特异性的抑制DNA修复功能从而增加其对放疗的敏感性,是国际肿瘤研究的新方向和新热点。探寻通过抑制前列腺癌细胞DNA损伤修复而增加放疗敏感性的新方法,成为晚期前列腺治疗的当务之急,具有重要的理论意义和临床价值。类胰岛素样生长因子受体(insulin-likegrowthfactorreceptor,igf1r)是胰岛素样生长因子系统(insulin-likegrowthfactorsystem,igfs)的成员之一,igfs信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对于多数细胞而言,igf-1是一种有效的有丝分裂原,它至少参与了两条细胞抗凋亡信号传导通路。一条由磷脂酰环己六醇-3-激酶(pi3k/akt)通路组成,另一条是由ras,raf和细胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulatedkinase,erk)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,mapk)组成。igf-1不仅可以促进细胞增殖,提高存活,而且在抑制凋亡方面起着重要作用。已有研究证明血清中igf-1水平的升高与胰腺癌,乳腺癌,子宫内膜癌等多种肿瘤的发生呈正相关。另一方面,igf-1还可以促进肿瘤细胞的转移。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)是调节细胞周期的关键因子。在人上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面均有高表达。研究表明,egfr在前列腺癌细胞中高表达,与pc的增殖、gleason评分、crpc转化均密切相关。以往的研究发现,igf1r和egfr在前列腺癌中有病理性的高表达,都可以通过pi3k/akt信号通路激活dna的损伤修复,与肿瘤的放疗抵抗密切相关。然而单一抑制igf1r或egfr对前列腺癌的治疗效果欠佳。虽然我们发现抑制igf1r可以通过抑制前列腺癌细胞的dna修复而对放疗增敏,抑制egfr也有类似效果,但是长时间单一抑制igf1r,可以负反馈激活egfr;长时间的单一抑制egfr,也负反馈激活igf1r。我们也发现,如果联合阻断igf1r和egfr,可以完全阻断pi3k/akt信号通路,而此通路已被证实与前列腺癌细胞的dna损伤修复密切相关。研究目的:研究联合抑制igf1r和egfr对前列腺癌放射治疗的增敏效应,并研究其分子机理。为在放疗前联合应用igf1r和egfr抑制剂进行新辅助生物治疗奠定理论基础,为高特异性放疗增敏提供潜在的分子靶点和标记物。研究方法:体外培养人前列腺癌细胞du145、pc3和arcape和arcapm,观察单独或同时阻断egfr和igf1r后上述细胞的放疗敏感性;体外培养克隆形成实验检测放射线联合或不联合egfr和igf1r抑制剂对人前列腺癌细胞的作用;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化;westem-blots检测akt、pakt的表达;免疫荧光实验检测γh2ax和rad51在细胞核内的焦点形成,证明联合抑制增强放射敏感性的机理;建立裸鼠移植瘤模型,在体观察联合抑制对放射治疗的敏感性,并检测前列腺癌细胞的增殖指数。研究结果:1.经erlotinib或ag1024处理后照射,前列腺癌细胞的生长活力显著降低,且肿瘤细胞的凋亡显著增加(p<0.05);经两种药物同时处理后和再进行照射,前列腺癌细胞的生长抑制和凋亡的增加更为显著(p<0.05)2.体外培养克隆形成实验分析显示联合使用erlotinib和ag1024在为放疗增敏方面具有协同效应。3.流式细胞实验结果显示联合给予erlotinib和ag1024可协同增加du145、pc3和arcape细胞的放疗敏感性,但arcapm细胞系只对的ag1024敏感,而对erlotinib不敏感;且du145对erlotinib的敏感性比pc3要高。提示两药联合可以进一步提高放疗诱发的肿瘤细胞凋亡。4.westem-blot实验结果显示,无论是egf还是igf,均可介导akt的磷酸化激活,联合给予egf和igf可以协同诱导akt和mapk的磷酸化。但是,akt和mapk的特异性抑制剂均不能影响dna同源性重组修复中的关键蛋白rad51的磷酸化激活,说明akt和mapk在同源性重组中不起关键作用。5.与对照组或单一使用ag1024或erlotinib相比,联合使用可有效地降低du145细胞的hrr水平(p<0.05)。而单独或联合使用erlotinib和ag1024处理du145细胞,nhej途径相关dna修复蛋白都没有收到影响。这表明erlotinib和ag1024通过hrr途径抑制dsb修复,而非nhej途径。6.人前列腺癌细胞du145裸鼠移植瘤实验显示:与非处理对照组相比γ-照射显著抑制了肿瘤的生长(p<0.05);与单纯照射组相比,单独ag1024或erlotinib后照射的抑瘤效果更明显(p<0.05);与单一处理后照射组相比,联合处理后照射组组肿瘤生长抑制最为明显(p<0.05)。对du145-iirs细胞,联合给予ag1024和erlotinib比单一处理更易增加其放疗敏感性。研究结论:对于雄激素非依耐性前列腺癌细胞,联合阻断EGFR和IGF1R可以显著地抑制前列腺癌细胞的生长,并协同抑制放射引起的DNA损伤的修复,其抑制的主要机理不是通过抑制非同源性末端连接,而是通过协同干扰同源性重组完成的。其信号转导是通过:(1)EGFR/IGF1R相互作用,但非直接相互作用。(2)通过协同抑制IRS1磷酸化,进而抑制核内Rad51焦点形成,而抑制同源性重组。