论文部分内容阅读
目的:脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）是缺血性脑卒中的重要病理机制,而神经细胞凋亡是细胞缺血和再灌注损伤后的主要死亡方式之一。玫瑰花总黄酮（Total flavonoids from Rosa rugosa,TFR）是从玫瑰花瓣中提取的总黄酮类化合物,在心脑血管疾病中具有保护作用。本实验将SD大鼠作为实验对象,观察TFR对CIRI大鼠的保护作用,并探讨其保护作用是否和调控PI3K/AKT信号通路抑制内质网应激,从而减轻神经细胞凋亡有关。方法:体内实验:采用线栓法建立大鼠中动脉阻塞/再灌注（Middle cerebral artery/reperfusion occlusion MCAO/R）模型。将正常的SD大鼠分为假手术组（sham组）、模型组（MCAO/R组）、模型组+TFR低剂量组（MCAO/R+50 mg/kg组）、模型组+TFR中剂量组（MCAO/R+100 mg/kg组）、模型组+TFR高剂量组（MCAO/R+200 mg/kg）、MCAO/R+TFR+LY294002组（MCAO/R+TFR+LY）。体外实验:提取并培养脑皮质区原代神经元,将细胞分为以下六组:对照组（Control组）、OGD/R组、OGD/R+TFR组、OGD/R+TFR+LY组、TFR组、LY组。旷场实验和Longa评分检测行为学功能;TTC染色观察脑组织梗死体积大小;干湿重法检测脑组织水肿程度;ELISA试剂盒检测脑组织中SOD和MDA含量;Nissl、HE染色检测脑皮质区病理学变化;TUNEL染色检测缺血区域神经细胞凋亡情况;运用Western Blot技术检测Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3、GRP78、CHOP及Caspase 12的蛋白表达,Hoechst33342结合流式细胞术检测神经元凋亡情况。结果:体内实验:（1）MCAO/R组大鼠Longa评分显著升高、运动总路程明显降低、大脑梗死体积显著增大,脑水肿程度加重均（均P＜0.001）。给予TFR中、高剂量预处理后可以降低大鼠Longa评分、增加运动总路程、降低大脑梗死体积,降低脑组织含水量（均P＜0.05,P＜0.01）。（2）MCAO/R组中脑组织SOD含量下降,MDA含量升高（均P＜0.001）,中、高剂量TFR预处理后SOD含量水平升高,MDA含量水平降低（均P＜0.01）;（3）Nissl染色结果显示MCAO/R组大量尼氏小体脱失溶解,HE染色观察到神经元核膜破环,核仁固缩,有大量空泡。中、高剂量TFR干预后尼氏小体溶解脱失现象有所缓解,神经元形态损伤减轻;（4）TUNEL染色观察到MCAO/R组大量神经细胞凋亡,中、高剂量TFR干预后,阳性凋亡细胞明显降低（P＜0.05,P＜0.01）;（5）Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达,中、高剂量TFR干预组凋亡相关蛋白Bax和Cleaved-caspase3（P＜0.05,P＜0.01）含量降低,Bcl-2蛋白含量表达增加（P＜0.05）;（6）Western blot法检测内质网应激相关蛋白,MCAO/R组内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP及Caspase12蛋白表达水平呈升高趋势（均P＜0.001）。给予TFR预处理后内质网应激相关蛋白表达水平下降（均P＜0.01）,给予PI3K/AKT信号通路抑制剂后,TFR的对内质网应激相关蛋白的作用被逆转（均P＜0.05）。体外实验:（7）与OGD/R组相比,给予药物TFR干预后,培养基中漂浮神经元明显减少,神经元形态完整性有所改善,给予PI3K/AKT信号通路抑制剂后,TFR的保护作用受到抑制;（8）Hoechst33342染色结合流式细胞术检测结果显示:TFR干预组较OGD/R组神经元凋亡率有所下降（P＜0.05）,给予PI3K/AKT信号通路抑制剂可以逆转TFR抑制神经元凋亡（P＜0.01）;（9）Western Blot结果显示:与OGD/R组相比,给予TFR预处理后,凋亡相关蛋白Bcl-2表达升高（P＜0.01）,Bax、Cleaved-caspase 3表达降低（P＜0.05,P＜0.01）。内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP及Caspase12表达均降低（均P＜0.01）。给予PI3K/AKT信号通路抑制剂后,TFR对凋亡和内质网应激相关蛋白的作用被抑制（均P＜0.05）。结论:TFR可以减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路抑制内质网应激反应,从而减轻神经细胞凋亡有关。