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猪附红细胞体(Mycoplasma suis, M.suis)在伯杰氏手册中被划分为立克次氏体,但目前国际上根据其16sRNA序列,普遍认为应属于支原体。M.suis是一种寄生于猪红细胞上的微生物,能够引起猪的溶血性贫血、黄疸等为主要特征的血液感染性疾病。近几年猪附红细胞体病在全国范围内大面积爆发和流行,对我国的养猪业造成极大的经济损失。为更好的控制该病的发生,我们必须从该病的病原上对其进行详细的研究。在Genebank中可以查到的能够表达成蛋白质的序列共有5条,分别是rnpB,无机磷酸酶,MSG1,HspA1和猪附红细胞体ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7、ORF8、ORF9、ORF10、ORF11 DNA序列,Hoelzle等通过鸟枪法对M.suis基因组文库进行测序,发现了MSG1蛋白,该蛋白与3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)具有高度同源性,并且该蛋白是具有粘附猪红细胞功能的M. suis膜蛋白,不同的分离株中MSG1的序列高度保守,并且证明HspA1蛋白具有三磷酸腺苷酶活性和抗原性,但对rnpB,无机磷酸酶和ORFs的功能知之甚少。由于M.suis没有最佳的培养方式,很大程度上限制了我们对M.suis的研究。而且M.suis编码的基因采用的是第4套密码子,与大肠杆菌表达系统有冲突,具体来说就是M. suis编码的TGA为色氨酸,但TGA在大肠杆菌表达系统中编码的却为终止密码子。因此,在本次试验中,我们根据GenBank中已发表的猪附红细胞体AJ504999序列的ORF2,ORF4,ORF5,ORF9基因,将密码子TGA改为TGG,并利用Graphical Codon Usage Analyser,将难以表达的大肠杆菌稀有密码子更换为易于表达的密码子。采用人工设计的引物,在最两端的引物上分别设计酶切位点,利用引物相互重叠覆盖整个ORF2,ORF4,ORF5,ORF9基因序列,从而得到整个ORF2,ORF4,ORF5,ORF9基因序列。先将ORFs基因连接到PMD18-T simple载体上,测序发现ORF2在518位发生基因缺失,又设计了OE-PCR的引物,将缺失的基因填补上,将测序正确的ORF基因亚克隆至原核表达载体pET28a及pET32a,构建重组表达载体PET-28a/ORF2,PET-28a/ORF4,PET-32a/ORF5, PET-32a/ORF9,并转入E.coli BL21中,在IPTG终浓度1mmol /L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,目的蛋白成功表达。同时通过生物信息学软件对其3D结构及蛋白功能等方面进行预测。综上所述,本研究首次利用全基因合成的方法克隆并成功表达了M.suis ORFs基因,同时分析了他们基因的二级结构,3D结构,跨膜结构,糖基化位点等功能,为研究ORFs蛋白功能奠定了基础,同时也为其它蛋白的研究提供新的实验方法和思路。