以玉米MCK1为探针筛选烟草的cDNA文库,得到两个高度同源的全长cDNA序列。本课题就以鉴定这两个cDNA所编码的蛋白质NtCPK4和NtCPK5为中心,开展了一系列的研究。首先分析了这两个蛋白质的氨基酸序列,发现它们编码两个高度同源的钙依赖型蛋白激酶。对于这两个蛋白激酶首先进行了酶活分析,确定其酶活依赖于Ca²⁺,并进一步分析了它们的酶活动力学常数。用毛细管电泳的方法鉴定了一个蛋白激酶的磷酸化的氨基酸。并对其中的一个基因进行了表达分析,采用的方法是以基因特异的序列为探针进行RNA原位杂交和Northern Blot分析。以GFP为标签,用基因枪转化洋葱表皮进行瞬时表达分析,表明NtCPK4和NtCPK5具有完全不同的亚细胞定位模式,进一步的点突变实验证明了N端可变区在蛋白激酶的亚定位中发挥重要的作用。 1.经序列分析表明,这两个cDNA均含有完整的阅读框,编码的蛋白具有钙依赖型蛋白激酶的保守结构域,即激酶区、自抑制区和钙调素相似区。这两个烟草cDNA所代表的基因分别命名为NtCPK4和NtCPK5,其中编码NtCPK4的cDNA全长为2360bp,包括5’非翻译区、阅读框和3’非翻译区,长度分别为198 bp、1719 bp和443 bp;而NtCPK5的cDNA全长为2368 bp,其5’非翻译区、阅读框和3’非翻译区长度分别为247bp、1704 bp和417 bp。进化树分析表明这两个蛋白激酶（NtCPK4和NtCPK5）在进化上处于CPK和CRK之间。 2.为了在生化上鉴定该激酶是钙依赖型蛋白激酶,本实验采用昆虫细胞表达系统表达了烟草的NtCPK4和NtCPK5蛋白,纯化蛋白后进行了激酶活性分析。结果表明这两个蛋白激酶在以histone Ⅲs为底物时,它的自磷酸化以及底物磷酸化的活性都是钙依赖性,可以快速的发生磷酸化。激酶的动力学曲线分析表明:在histone Ⅲs为底物的条件下,NtCPK4的Vmax是588 nmol min^-1。mg^-1,Km值为176 μg ml^-1,在syntide-2为底物的条件下,NtCPK4的Vmax是2415 nmol min^-1mg^-1,Km值为58 μM。而NtCPK5在histone Ⅲs为底物的条件下,NtCPK4的Vmax是526 nmol min^-1mg^-1,Km值为210μg