前列腺癌是老年男性生殖系常见的恶性肿瘤。在国外,前列腺癌为男性发病率最高的恶性肿瘤,死亡率仅次于肺癌,位居第二。我国前列腺癌发病率呈明显上升的趋势,己列居泌尿系肿瘤的第三位,前列腺癌已成为严重危害男性健康和生命的主要疾病。传统的前列腺癌治疗手段包括手术、激素治疗、化疗放疗等方法。由于前列腺癌的发病隐匿性及晚期对激素的非依赖性,目前尚无有效的手术和激素治疗手段。消除雄激素非依赖性癌细胞是前列腺癌治愈的关键,寻求以激素非依赖性细胞为靶标的前列腺癌治疗手段一直是人们努力的方向。化疗、放疗等手段缺乏对靶细胞选择的高特异性,全身毒副作用大,极大地限制了其临床应用。因此,如何有效地克服传统化疗药物的全身毒性,增强其杀灭前列腺癌细胞的特异性,是摆在各国学者面前的迫切难题。随着现代分子生物学技术的发展以及人们对前列腺癌分子发病机理认识的深入,前列腺癌基因治疗也取得了很大进步,目前主要的策略包括:促进肿瘤细胞发生凋亡;提高机体对肿瘤细胞的免疫反应;诱导肿瘤细胞产生“自杀效应”。而基因治疗存在着治疗基因的表达靶向性差及治疗基因转运效率低等缺点,用组织特异性启动子调控治疗基因使之在特定的组织中靶向性表达是提高基因治疗靶向性的有效手段,适用范围广。Survivin是一种具有肿瘤特异性表达的细胞凋亡抑制因子,是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)中的新成员,主要表达于细胞G2/M期,survivin在细胞中的生理功能涉及到细胞周期的调控、细胞凋亡和肿瘤中血管的生成等,它表达于几乎所有人类肿瘤组织中,但极少见于正常组织。鉴于survivin在细胞凋亡中起到的重要作用,近年来已成为肿瘤基因治疗的重要靶点使其有可能成为肿瘤基因治疗理想的新靶点。目前,常用的肿瘤组织特异性启动子survivin已证实在大多数肿瘤细胞中表达,而在正常组织中不表达。Caspases是一类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族,其中caspase-3在凋亡的信息传递中居于核心地位。目前将caspases应用于肿瘤基因治疗的所采取的策略包括:①促进caspases的过量表达,尤其是caspase-3、6、7等效应caspase分子的过表达。②直接导入活性caspase分子。应用caspases作为效应分子为人们提供了一种基因治疗的新思路。RNA干涉是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默现象。当前,RNAi已发展成为一种高效的实验工具,用于高效特异地关闭或降低特定基因的表达,显示了非常广阔的应用前景。microRNAs是近年来研究发现的一类新型的小分子RNAs,在高等生物的正常发育中起着举足轻重作用,其表达和功能的异常变化会在包括肿瘤在内的重大疾病中起着重要作用本研究首先针对survivin启动子序列设计引物,PCR获得两条启动子S26830和S2681序列,将它们插入pGL3-Basic载体和pPRIME载体,构成荧光素酶和GFP重组质粒,转染前列腺癌细胞PC-3、LNCap、宫颈癌细胞Hela和永生化细胞Chang liver,观察其荧光素酶活性和GFP的表达,比较这两段启动子活性。结果显示:S26830和S2681在三种肿瘤细胞中荧光素酶和GFP均有较高表达,约为CMV活性的三分之一。而在正常Chang liver细胞中几乎不表达,说明survivin启动子具有肿瘤特异性。且S26830的活性较S2681的强,各细胞表达不同,S2681约为S26830的20%～40%。故我们选用S26830做下一步试验。随后,我们用microRNA表达载体pPRIME构建了针对survivin基因的microRNA表达载体。即根据microRNA设计原则设计并合成了3条针对survivin的microRNA片段,通过PCR在两端添加酶切位点,克隆入pPRIME载体,用脂质体法转染非雄激素依赖前列腺癌细胞系PC-3,运用免疫印迹和RT-PCR技术观察三个microRNA对PC-3细胞中survivin的表达变化。MTT法检测survivin基因沉默后PC-3的细胞生长影响。结果表明: pPRIME-SV1和pPRIME-SV2重组载体均有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达。与对照组相比,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调,并且转染PC-3细胞后,细胞生长速度明显变慢,其细胞数在84h时与对照组相比减少约40%。最后,为了进一步观察肿瘤特异性启动子的靶向作用,同时增加凋亡分子对前列腺癌细胞PC-3的影响,我们选取前面抑制效果较好的pPRIME-SV2重组质粒,将第一部分鉴定活性较强的survivin启动子片段S26830替换掉pPRIME-SV2重组质粒中的CMV启动子,同时将具有活性的Caspase-3分子替换了载体中的GFP片段,构成了一系列重组质粒转染前列腺癌PC-3细胞,通过流式细胞术和电镜观察其细胞凋亡和细胞内结构及对化疗药物的敏感性等方面的变化。流式细胞术结果显示,重组质粒添加活性caspase-3后,其细胞凋亡数比没有caspase-3的重组质粒明显增加,且对化疗药物的敏感性进一步增强。Survivin启动子调控的重组质粒较CMV启动子促细胞凋亡能力弱。电镜观察细胞结构和细胞器变化也显示核固缩、染色质浓缩和凋亡小体形成等典型凋亡细胞特征。本研究基于survivin的肿瘤组织特异性,构建由survivin调控的凋亡分子和microRNA表达载体,观察其在前列腺癌细胞PC-3中的杀伤作用,实现既利用肿瘤组织特异性survivin靶向的microRNA使其基因沉默,以解除survivin对细胞凋亡的抑制作用,同时又增加凋亡分子caspase的表达,从而特异性地促进前列腺癌细胞的凋亡的目的。