论文部分内容阅读
甘草酸(glycyrrhizic acid, GL)是甘草中最主要的活性成分,水解后产生二分子葡萄糖醛酸(glcuronic acid)和一分子甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)。由于三萜皂苷母核18位手性碳原子(C-18)构型的不同,甘草酸存在一对差向异构体,即18α-甘草酸(α-GL)和18β-甘草酸(β-GL),两者水解后可生成相应的18α-甘草次酸(α-GA)和18β-甘草次酸(β-GA)。早期对甘草酸、甘草次酸的研究大多没有将两个异构体明确区分,但随着具有我国自主知识产权的“手性肝药”异甘草酸镁在2006年上市,甘草酸18位差向异构体的差异日益受到国内外学者的关注。从药物转运的角度,本文研究了甘草酸18位差向异构体及其水解产物对P-糖蛋白的影响。目的研究甘草酸18位差向异构体及其水解产物对P-gp功能和表达的影响,探讨其对P-gp的作用是否具有立体选择性；通过研究甘草酸18位差向异构体水解产物在Caco-2细胞上对P-gp底物转运的影响,进一步确证功能和表达实验结果；通过研究甘草酸制剂对他林洛尔药动学的影响,初步探讨甘草酸制剂与P-gp底物在临床上可能发生的相互作用。方法1. RP-HPLC法分离并测定甘草酸制剂中的18α-、18β-甘草酸采用Phenyl-Hexyl (4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为10mmol·L-1醋酸铵溶液(pH=7.75)-乙腈(83:17),流速1.0 mL/min,柱温38℃,检测波长250 nm。2.细胞培养及单层模型的建立采用MEM培养基常规培养Caco-2细胞、脐静脉内皮细胞(ECV304),用于研究甘草酸18位差向异构体及其水解产物对P-gp功能和表达的影响。采用苯基溴化四氮唑蓝法(MTT),判断各试验药物的体外最大非细胞毒性剂量,保证试验过程中细胞的活性,并为甘草酸18位差向异构体及其水解产物对P-gp功能和表达以及P-gp底物转运影响的研究提供与细胞作用的最大浓度。3.罗丹明123摄取实验研究药物对P-gp功能的影响以ECV304细胞作阴性对照细胞,维拉帕米作为抑制P-gp功能的阳性对照,使用流式细胞术测定罗丹明123(Rho-123)荧光值,分析甘草酸18位差向异构体及其水解产物对P-gp底物—Rho-123被Caco-2细胞摄取的影响,以此反映P-gp功能的变化。4.实时荧光定量PCR检测MDR1 mRNA表达以环孢素A作为上调MDR1 mRNA表达的阳性对照,不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照,Real-time PCR检测MDR1 mRNA,研究甘草酸18位差向异构体及其水解产物对MDR1 mRNA表达的影响。5.流式细胞术和Western blot检测P-gp蛋白表达以环孢素A作为诱导P-gp蛋白表达的阳性对照,不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照,采用流式细胞术(FCM)和Western blot分别研究α-GL和β-GL、α-GA和β-GA对P-gp蛋白表达的影响。6. Caco-2细胞单层模型上P-gp转运实验在TranswellTM12孔板上建立Caco-2细胞单层模型,使用酶标仪测定转运液中Rho-123的浓度,分别考察药物瞬时作用下对Rho-123双向转运的影响以及药物干预72h后Rho-123双向转运的变化。HPLC测定转运液中他林洛尔的浓度,进一步在Caco-2细胞单层模型上考察药物干预72h后他林洛尔外向转运的变化。7.甘草酸制剂对他林洛尔药动学的影响采用2×2双交叉试验设计。14名受试者随机等分为2组,一组先服用复方甘草酸苷片6天,每天三次,每次三片,第7天服用他林洛尔片1片,即试验组；另一组先服用安慰剂6天,每天三次,每次三片,第7天服用他林洛尔片1片,即对照组。受试者服药前及服药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、16和24h取静脉血5mL置肝素化离心管中,分离出血浆,置-70℃冰箱中保存待测。采用HPLC法测定血浆中他林洛尔的浓度。使用DAS2.1.1软件计算药动学参数,SPSS 13.0软件进行统计分析。结果与结论1.各制剂中α体和β体甘草酸的组成比各不相同,亟待制定甘草酸制剂中异构体含量的相关质量标准。2.α-GL、β-GL对P-gp的影响作用方向呈现相反的趋势。中、高浓度(10μmol·L-1、60μmol·L-1)α-GL对P-gp功能表现出抑制作用,但没有呈现出剂量依赖性。β-GL各浓度对P-gp功能表现出诱导作用,也没有表现出剂量依赖性；中、高浓度(10μmol·L-1、60μmol·L-1)α-GL下调MDR1 mRNA表达,β-GL只在高浓度60μmol·L-1上调了MDR1mRNA表达；高浓度(60μmol·L-1)β-GL在蛋白水平对P-gp有诱导作用,α-GL各浓度没有表现出对P-gp表达的影响。转录水平上α-GL、β-GL对P-gp的影响与α-GL、β-GL对CYP3A的影响呈现一定的同向性,甘草酸18位差向异构体对CYP3A与P-gp的影响有相似的立体选择性,其机制是否与孕烷X受体(PXR)有关,有待进一步研究。3.α-GA、β-GA对P-gp的作用可能存在程度上的差别,而且18α-、18β-甘草次酸对P-gp的影响与其母体甘草酸的作用趋势并不一致。中、高浓度(1μmol·L-1、10μmol·L-1)α-GA对P-gp功能表现出诱导作用,并呈现出剂量依赖性。高浓度(10μmol·L-1)β-GA对P-gp功能表现出诱导作用；高浓度(10μmol·L-1)α-GA上调MDR1 mRNA表达,实验浓度β-GA未影响MDR1 mRNA的表达；高浓度(10μmol·L-1)α-GA在蛋白水平对P-gp有诱导作用,实验浓度β-GA没有表现出对P-gp表达的改变。甘草酸苷水解后与其苷元甘草次酸对P-gp的影响存在区别,其机制有待进一步研究。4.P-gp底物转运试验中,高浓度(10μmol·L-1)α-GA瞬时作用于Caco-2细胞单层模型,或者干预单层模型72h后,均能诱导P-gp底物Rho-123外向转运；高浓度(10μmol·L-1)β-GA瞬时作用于Caco-2细胞单层模型没有表现出诱导作用,但在干预Caco-2单层模型72h后,表现出对Rho-123外排的诱导；他林洛尔的外向转运受α-GA、β-GA干预72h后的影响与Rho-123受α-GA、β-GA干预72h的结果相似。α-GA诱导P-gp底物外排的能力比β-GA强。鉴于α-GA、β-GA对Caco-2细胞干预72h后均能不同程度的促进P-gp底物Rho-123和他林洛尔的外向转运,甘草酸上调MDR1,诱导外源性物质的外排,可能是甘草解毒的机制之一。5.他林洛尔药动学试验表明,复方甘草酸苷没有增加他林洛尔的不良反应,总体上也没有对其药动学产生影响。但有可能是因为样本数量不够多、群体的个体差异而使药动学参数改变没有表现出统计学意义。也有可能是试验设计服用复方甘草酸苷的时间不够长,未能产生对肠道P-gp的诱导。虽然国内外多数研究采用了他林洛尔作为P-gp相关人体试验的探针药物,其是否能准确反映P-gp的变化情况,有待进一步确证。鉴于本研究体外实验发现α-GA可能比β-GA有更强的诱导P-gp的能力,α体甘草酸制剂对P-gp底物药动学的影响有待进一步研究,并且由于纯α体甘草酸制剂临床应用时间还不长,临床上与其他药物同时使用时,应注意观察是否有药物相互作用的发生。根据本研究的提示和相关文献报道,差向异构体之间虽然只是立体构型的不同,但对药物转运体的影响可能会有不同的表现,在药物研究与开发中应当引起一定的重视。