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牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD)由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起,可引起牛群临床和病理学症状,表现为繁殖障碍、胎儿畸形及广泛的免疫抑制,导致牛群生产力低下和严重的粘膜病,从而造成世界范围养牛业的重大损失。牛病毒性腹泻病毒基因组编码11种蛋白,其中E2蛋白是病毒主要的保护性抗原,能诱导中和抗体的产生,保护实验动物不受同源毒株的攻击。利用已有的表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化表达菌BL21(DE3),经培养诱导表达出重组E2蛋白,Western blot显示纯化的重组E2蛋白能够与BVDV阳性血清反应。用纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和抗体效价为1:2048。间接免疫荧光和免疫印迹试验证实了其具有良好的反应性。间接免疫荧光试验证明其在1∶1280倍稀释时仍具有较高的活性。本研究所制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于国内BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA奠定了基础。将纯化后的BVDV E2蛋白作为包被抗原建立了检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA,将其命名为E2-ELISA。通过一系列试验,确定了重组抗原最佳包被浓度(12.8μg/ml);最佳封闭液(1%明胶)和最佳封闭时间(60min);血清样本最佳稀释度(1:160)和最佳作用时间(60min);酶标二抗最佳工作浓度(1:5000)和最佳作用时间(60min);底物最佳显色时间(10min);判定临界值(OD≥0.364者判为阳性,OD<0.364者判为阴性)。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见6种牛病的阳性血清不发生交叉反应。阻断试验表明,BVDV细胞培养液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显的影响。重复性试验表明,批内重复的变异系数小于10%,批间重复的变异系数小于10%。与病毒中和试验相比,符合率、特异性和敏感性分别为86.3%、82.6%和87.7%。与瑞典进口全病毒ELISA诊断试剂盒相比,符合率、特异性和敏感性分别为87.5%、85%和88.3%。应用BVDV E2-ELISA检测了黑龙江省内的852份牛血清样本,其抗体阳性率为74.18%(632/852)。上述结果表明,BVDV E2-ELISA诊断方法具有较好的敏感性和特异性,显示出了良好的应用前景。本研究成功表达了BVDV E2基因,获得了以包涵体形式表达的重组E2蛋白,制备了具有高病毒中和活性和特异性的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体。同时利用纯化的重组蛋白成功建立了快速简便的BVDV E2-ELISA。这些研究为BVDV的检疫及控制提供了有力的技术支持。